专利名称：2－甲氧基雌二醇，硫酸新霉素及其混合物的抗癌用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗领域。具体地，本发明涉及一种新的抑制血管增生从而抑制癌细胞生长和转移的药物。更具体地，本发明公开了2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素可用于抑制血管生成因子核转移的过程从而降低新生血管的形成。
背景技术：
肿瘤生长和转移对血管新生的依赖性已经被科学界广泛接受。除非建立其自己的血管网络，否则肿瘤组织只能长到直径1-2毫米的大小。这样大小的肿瘤对人体不构成危害。目前一个广泛被关注和接受的理论是长期使用抑制血管生成的药物，可使肿瘤细胞一直处于潜伏期。这样，癌症就象高血压和糖尿病一样可以长期用药物控制。这是目前癌症治疗研究的一个重要方向(Harris AL.Antiangiogenesisfor cancer therapy.Lancet1997；349 Suppl 2SII13-5.)。
实体肿瘤和血管生成的密切关系是最早被认识到的。已经知道各种恶性肿瘤如肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、骨瘤、上皮瘤等等都分泌血管生成因子。从肿瘤发生的器官上分类，已知人体内各种器官癌变如肺癌、肝癌、乳癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌以及头和颈癌等等都和血管增生密切相关(Hui YF，Ignoffo RJ.Angiogenesisinhibitors.A promising role in cancer therapy.Cancer Practice1998；6(1)60-2.)。
最近的实验结果也证明，各种体液癌如各类白血病和淋巴癌也和血管增生有关(Schneider P，Jerome MV，Paysant J，Soria PC，Vannier JP.The role ofangiogenesis in leukemia proliferation.American Journal of Pathology1999；155(3)1007-8.)。这样，几乎人体内所有恶性和良性的肿瘤都与血管增生有关。
血管增生和肿瘤的转移也有密切的关系。这个关系体现在两方面，一是原始肿瘤必须依靠血管生成才能进入血液循环，到达转移目的地。二是当进入血液循环的肿瘤细胞在目的地着床以后，必须促使新生血管的形成以达到生长，扩大的目的。
血管增生是指从一个已经存在的血管派生出微血管形成一个微血管网络形成微循环的一个过程(Yancopoulos GD，Klagsbrun M，Folkman J.Vasculogenesis，angiogenesis，and growth factorsephrins enter the fray at the border.Cell 1998；93(5)661-4.)。血管增生是一个由几个步骤所组成的一整套过程。它是正常生理过程如生育，成长，伤口愈合，月经周期所必需得，并且同时在多种病理过程中，如肿瘤生长和转移，风湿性关节炎，糖尿病，视网膜病，牛皮癣等中起着关键作用。从细胞和生化水平上看，血管生成分四个步骤(1)正常血管内皮细胞受血管生成因子的刺激而激活；(2)激活的血管内皮细胞侵入周围组织向着血管生成因子所在的方向移动；(3)跟随其后的血管内皮细胞分裂填补移动细胞所留空隙；(4)新形成的微血管吻合，成熟而成一个具有功能的循环系统。所以，血管增生是一个持续的不间断的复杂过程。每个具体步骤的机理以及调控因子已基本阐明。
血管生成是一个多步骤的复杂过程。所以，血管生成的调控也是复杂的。这是一个动态的、控制非常严密的过程，是由血管生成因子以及血管生成抑制剂所决定的。目前已知的血管生成因子有大约二十五种(Iruela-Arispe ML，Dvorak HF.Angiogenesisa dynamic balance of stimulators and inhibitors.Thrombosis& Haemostasis 1997；78(1)672-7.)。它们的理化性质各不相同。但都有一个共同的性质，那就是促进血管的生成。它们都已被纯化测序，其基因都已被克隆。比较常见的血管生成因子有血管生成素(Angiogenin)，血管内皮生长因子(VEGF)，酸性及碱性成纤维生长因子(aFGF和bFGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板生长因子(PDGF)，血小板激活因子(PAF)，血小板内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子(IGF)以及白细胞介素-8(IL-8)等等。在很多情况下，这些生长因子在血液中的浓度和肿瘤生长呈正相关。
它们的另外一个共同特征是在已知的血管生成因子中，有九个因子需要转移至血管内皮细胞核中才能起促使血管生成的作用。这九个因子包括血管生成素、酸性成纤维生长因子、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子、血小板内皮生长因子、胰岛素样生长因子等。
血管生成素是一个具有强烈刺激血管生成活力的蛋白质，人血管生成素由123个氨基酸组成，分子量为14400，等电点为9.2。血管生成素最早于1985年被发现，是第一个也是到目前为止唯一的一个仅仅靠测定体内血管生成活力而提纯分离的血管生成因子(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL.Isolation and characterization ofangiogenin，anangiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry1985；24(20)5480-6.)。在众多的血管生成因子中，血管生成素诱导血管新生的活力是最高的，在受精鸡蛋绒毛膜(Chorioallantoic Membrane)的测定血管生成的活力体系中，1纳克(1ng)的纯血管生成素就有明显的促使血管生成的活力。所以，血管生成素在血管生成领域有其特殊的意义。
最近发现，血管生成素直接进入细胞核，集中在核仁里，和DNA结合而直接作用于细胞的基因转录系统(Hu G，Xu C，Riordan JF.Human angiogenin is rapidlytranslocated to the nucleus of human umbilical vein endothelial cells andbinds to DNA.J Cell Biochem2000；76(3)452-62.)。核转移是血管生成素行使促使血管增生活力过程中所必需的。
酸性及碱性成纤维生长因子是另一类非常重要的血管生成因子。特别是碱性成纤维生长因子，其促使血管内皮细胞生长和分裂的活力是所有血管生成因子中最高的。所以，酸性及碱性成纤维生长因子在血管生成领域也有其重要的贡献。和血管生成素一样，酸性及碱性成纤维生长因子也需要转移到细胞核里才能充分发挥作用。
然而，迄今为止，本领域尚没有有效抑制肿瘤生长和/或治疗肿瘤的药物，尤其是通过有效抑制血管生成起作用的药物。本领域迫切需要开发新的通过有效抑制血管生成，从而治疗与血管生成过度有关的疾病的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的血管生成抑制剂，用于高效、低毒地抑制血管生成因子的核转移，进而治疗与血管生成过度有关的疾病，包括各种实体肿瘤、各种白血病及风湿性关节炎、糖尿病视网膜病，爱滋病综合症等等。
本发明人通过广泛而深入的研究，通过对人血管生成素及酸性及碱性成纤维生长因子作用机理的阐述，发现了硫酸新霉素能抑制人血管生成素的核转移，从而抑制血管新生最终导致肿瘤生长的抑制。本发明人还发现，2-甲氧基雌二醇能抑制酸性及碱性成纤维生长因子的核转移，从而抑制血管新生最终导致肿瘤生长的抑制。2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素的混合物非常有效地抑制人体肿瘤在裸鼠身上的生长。在此基础上，完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)治疗有效剂量的2-甲氧基雌二醇及其类似物，(b)治疗有效剂量的硫酸新霉素及其类似物，以及药学上可接受的载体。
在一优选例中，2-甲氧基雌二醇及其类似物的有效剂量为每日每公斤体重0.1-50毫克。
在另一优选例中，硫酸新霉素及其类似物的有效剂量为每日每公斤体重1-60毫克。
在另一优选例中，所述药物组合物通过以下形式给药口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、腹膜注射和皮下注射。
在另一优选例中，所述的2-甲氧基雌二醇及其类似物选自下组2-甲氧基雌二醇，2-乙氧基雌二醇，α-雌二醇，β-雌二醇，2-甲氧基雌二酮，2-乙氧基雌二酮，或其混合物。
在另一优选例中，所述的硫酸新霉素及其类似物包括新霉素A(新霉胺)，新霉素B，新霉素C，或其混合物。更佳地是新霉素A。
在本发明的第二方面，提供了2-甲氧基雌二醇及其类似物，以及硫酸新霉素及其类似物的用途，用于制备治疗由于血管增生过度所致的人体疾病。在一优选例中，所述的疾病选自乳癌和肝癌。
图1显示了硫酸新霉素抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞的核转移。
图2显示了硫酸新霉素抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子刺激血管内皮细胞分裂的活力。
图3显示了2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞的核转移。
图4显示了2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子刺激血管内皮细胞分裂的活力。
图5显示了硫酸新霉素抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长。
图6显示了2-甲氧基雌二醇抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长。
图7显示了2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素混合物抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长。
图8显示了人乳腺癌和肝癌细胞对2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素混合物的高敏感性。
具体实施例方式
本发明所指的2-甲氧基雌二醇及其类似物包括2-甲氧基雌二醇，2-乙氧基雌二醇，α-雌二醇，β-雌二醇，2-甲氧基雌二酮，2-乙氧基雌二酮等。最佳为2-甲氧基雌二醇。2-甲氧基雌二醇是雌二醇的自然生理代谢产物，在具体实施过程中，2-甲氧基雌二醇可以从雌二醇合成。
本发明首次公开了2-甲氧基雌二醇可抑制酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞的核转移的活力。由于酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞的核转移是血管生成过程的必需步骤，2-甲氧基雌二醇及其类似物所以具有强烈的抑制血管生成的活力和抗癌作用。硫酸新霉素是Waksman于1949年发现的(Waksman SA，Lechevalier HA.Neomycin，a new antibiotic active againststreptomycin-resistant bacteria，including tuberculosis organisms.Science1949，25305-307)，是氨基糖苷抗菌素的一种。硫酸新霉素及其类似物都可用于本发明，其中包括新霉素A(新霉胺)，新霉素B，新霉素C等。最佳为新霉素A(新霉胺)，因为且肾毒性和听觉神经毒性比新霉素低了30倍。新霉胺可以用常规方法从新霉素制备，或购得。
本发明首次公开了新霉素A(新霉胺)抑制血管生成素及其酸性及碱性成纤维生长因子诱导的血管内皮细胞的生长的活力及刺激血管生成的活力。
本发明也首次公开了硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇直接抑制肿瘤细胞生长的活力。这样双管齐下，新霉素具有强烈的抗癌作用。
一种特别优选例为2-甲氧基雌二醇和新霉胺联合使用。2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子的核转移从而抑制它们诱导的血管生成。新霉胺抑制血管生成素的核转移从而抑制它诱导的血管生成。由于酸性及碱性成纤维生长因子和血管生成素为诱导血管生成的三个最重要的因子，2-甲氧基雌二醇和新霉胺的联合使用能最有效地抑制新生血管的形成和肿瘤的生长。
由于核转移本身是一个多步骤的过程，这提供了多个可以用来抑制血管生成因子活力的途径。而且由于血管生成因子的核转移是血管生成过程中所必需的，抑制血管生成因子的核转移，在肿瘤治疗上有着现实意义。
由于硫酸新霉素及其类似物可抑制血管生成素的核转移，所以非常有效地抑制血管生成素的生物活力。由于2-甲氧基雌二醇及其类似物抑制酸性及碱性成纤维生长因子的核转移，所以非常有效地抑制酸性及碱性成纤维生长因子的生物活力。
本发明的应用范围包括所有与血管增生过度有关的疾病。
首先，本发明所提供的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素可用于治疗人体与血管增生过度有关的疾病，其中包括但并不限于风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
其次，鉴于血管增生和肿瘤生长及转移之间的密切关系，本发明所提供的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素，不仅能抑制原始肿瘤的生长和扩展，同时也能抑制肿瘤转移的发生和扩大。适用的肿瘤例子包括但并不限于各种实体肿瘤和白血病，如肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
更佳地，本发明所公开的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素及两者的联合使用可以治疗人体各种实体肿瘤和白血病。更具体地，2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素的混合物对乳癌及肝癌有特效。
肿瘤需要血管增生建立肿瘤血管循环系统来提供其快速生长所需的养料和排除废料。本发明通过抑制血管增生而达到抑制肿瘤生长与转移的目的。临床实验已经证明，血管新生抑制剂能有效地抑制各种人体肿瘤的生长和转移，并且没有抗药性。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有治疗有效剂量的本发明2-甲氧基雌二醇和/或硫酸新霉素以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1毫克/千克体重-50毫克/千克体重的2-甲氧基雌二醇，较佳地每天0.5毫克/千克体重-20毫克/千克体重的2-甲氧基雌二醇，和每天1毫克/千克体重-60毫克/千克体重的硫酸新霉素，较佳地每天2-30毫克/千克体重的硫酸新霉素。2-甲氧基雌二醇及其类似物和硫酸新霉素及其类似物可以在二者的有效剂量范围内以任意比例混合，较佳的比例是1∶100～100∶1(重量)，更佳地为1∶10-10∶1(重量)。
使用药物组合物时，是将治疗有效量的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1毫克/千克体重的2-甲氧基雌二醇或其类似物和1毫克/千克体重的硫酸新霉素或其类似物，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重2-甲氧基雌二醇和60毫克/千克体重的硫酸新霉素，较佳地该剂量是约0.5-20毫克/千克体重的2-甲氧基雌二醇或其类似物和3-20毫克/千克体重的硫酸新霉素或其类似物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)口服，肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
此外，2-甲氧基雌二醇及其类似物和硫酸新霉素及其类似物可以预先混合或分别但是同时以相同或不同的形式给药，包括(但并不限于)口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、腹膜注射，皮下注射，皮内注射。
本发明的2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素不仅可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如反义寡核苷酸，TNF-α、TGF-β，IFN-α，Angiostatin，Endostatin，甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、甲基ECNU、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
本发明具有以下优点1)本发明的最大优点在于其高效性和专一性。本发明针对血管生成因子，包括血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子在内，在血管内皮细胞内的核转移为目标设计了专一有效的抑制剂。由于硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇能同时抑制几种血管生成因子的核转移，其效果比单单针对一个血管生成因子的抑制剂要好。同时，硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇只抑制血管生成因子新诱导的血管生成，对已经存在的血管没有不良作用，所以其毒性比针对血管内皮细胞的广普抑制剂要低。
2)本发明的另一优点是老药新用。硫酸新霉素作为抗菌素已经在临床使用50多年，其毒理、药理、及药代动力学已研究的很清楚。雌二醇是常用避孕药。2-甲氧基雌二醇是其正常代谢产物，可以由雌二醇合成。所以，基于本发明所公开的硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇的抗血管生成作用所开发的抗肿瘤制剂成本低，试期短。这是老药新用的特点，有事半功倍的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1材料的获得本发明所用材料来源如下。人血管生成素由用常规重组核糖核酸方法制备或购得。碱性及酸性成纤维细胞生长因子(bFGF and aFGF)由美国Promega公司购入；血管内皮细胞专用培养基(HE-SFM)由美国Gibco/BRL公司购入。雌二醇，2-甲氧基雌二醇，硫酸新霉素由美国Sigma公司购入。人胎盘静脉血管内皮细胞(HUVE)由美国Cell Systems公司购入；人结肠腺癌细胞HT29，人前列腺癌细胞PC3，人子宫颈癌细胞HeLa，人神经胶质瘤细胞SW1088，人乳腺癌细胞MCF7和人肝癌细胞HepG2从美国ATCC购入；癌细胞培养基DMEM及胎牛血清(FBS)由美国Biowhittaker公司购入。实验用有免疫缺陷的裸鼠由美国Charles River公司购入。
实施例2细胞培养人胎盘静脉血管内皮细胞(HUVE)培养于含有10％胎牛血清及每毫升10纳克碱性成纤维细胞生长因子的血管内皮细胞专用培养基(HE-SFM+10％FCS+10ng/mlbFGF)中。培养条件为37摄氏度恒温恒湿，5％二氧化碳气相。每隔二天换一次培养基，以1∶3的比率传代培养。用第三代至第十五代的HUVE细胞做实验。
人结肠腺癌细胞HT29，人前列腺癌细胞PC3，人子宫颈癌细胞HeLa，人神经胶质瘤细胞SW1088，人乳腺癌细胞MCF7和人肝癌细胞HepG2培养在含有10％胎牛血清的DMEM中。以1∶4的比率传代培养。
实施例3硫酸新霉素抑制血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子在血管内皮细胞中的核转移血管内皮细胞是组成血管的主要细胞，也是众多血管生成因子的靶细胞。这种细胞在血管生成因子的刺激作用下迁移，分裂，重新组合而形成新生血管的雏形。血管生成因子包括血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子必须进入血管内皮细胞核才能行使其功能。本实施例证明了硫酸新霉素能有效抑制血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子的核转移。
HUVE细胞用胰蛋白酶-EDTA处理，用血球计数板或Coulter计数器测定细胞数，然后以每平方厘米五千个细胞的密度培养在35-mm细胞培养皿中。24小时以后，用不含血清的HE-SFM洗三次，加入1毫升PBS，然后加入同位素125I标记的血管生成素或碱性、酸性成纤维细胞生长因子于37℃在不同的硫酸新霉素浓度下保温。所用具体浓度为125I-血管生成素，1μg/ml；123I-碱性纤维生长因子，10ng/ml；125I-酸性成纤维生长因子，10ng/ml；硫酸新霉素，5-200μM。30分钟后，进行亚细胞器分离得到细胞核组分，同位素计数测定细胞核内血管生成因子的含量。
图1显示硫酸新霉素十分有效地抑制血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子在人胎盘静脉血管内皮细胞中的核转移。其中血管生成素对硫酸新霉素最为敏感，在5μM浓度的硫酸新霉素下，125I-血管生成素的核转移已被抑制50％。
实施例4硫酸新霉素抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子刺激血管内皮细胞分裂的活力血管生成因子在血管内皮细胞中的核转移是其行使促细胞生长活力所必需的。图1显示了硫酸新霉素抑制血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子在人胎盘静脉血管内皮细胞中的核转移。本实施例测定了硫酸新霉素抑制血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子诱导血管内皮细胞分裂的活力。
HUVE细胞以每平方厘米五千个细胞的密度在血管内皮细胞完整培养基中培养24小时，在用无血清HE-SFM洗二次后，在无血清HE-SFM种继续培养24小时。用HE-SFM洗一次后，加不同浓度的硫酸新霉素(5-200μM)并加入1μg/ml血管生成素或10ng/ml碱性及酸性成纤维生长因子刺激细胞生长。继续在37摄氏度保温48小时，收集细胞，用COULTER计数仪测定细胞数。
图2显示了硫酸新霉素有效地抑制了血管生成素和碱性及酸性成纤维细胞生长因子刺激人胎盘静脉血管内皮细胞分裂的活力。和核转移的结果相似，血管生成素对硫酸新霉素最为敏感，在5μM浓度的硫酸新霉素下，血管生成素诱导的HUVE细胞分离已被抑制50％以上。在100μM硫酸新霉素存在下，HUVE细胞对血管生成素完全脱敏。
实施例5
2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞的核转移2-甲氧基雌二醇是雌二醇(常规避孕药的主要成分)的代谢产物。有报道显示2-甲氧基雌二醇抑制细胞内微管(Microtubule)系统的功能。由于微管系统是细胞内分子转送的一个主要途径，本实施例检测了2-甲氧基雌二醇抑制血管生成因子在血管内皮细胞内核转移的活力。
HUVE细胞按实施例3所述方法培养。α-雌二醇，β-雌二醇及2-甲氧基雌二醇的浓度为100μM.125I-血管生成素，1μg/ml；123I-碱性纤维生长因子，10ng/ml；125I-酸性成纤维生长因子，10ng/ml；保温时间30分钟。
图3显示了2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子在HUVE细胞内的核转移，但是对血管生成素的核转移没有太明显的影响。同时，α-雌二醇，β-雌二醇有一定的抑制能力但没有2-甲氧基雌二醇有效。
实施例62-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子刺激血管内皮细胞分裂的活力酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞内的核转移是其行使促进细胞生长活力所必需的。由于2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子的核转移，本实施例检测了其抑制血管内皮细胞分裂的作用。
具体实施方法按实施例4所述进行。不同浓度的2-甲氧基雌二醇和10ng/ml的酸性或碱性成纤维生长因子先后加入细胞，在37℃，收集细胞，用COULTER计数仪测定细胞数。
图4显示了2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子刺激诱导HUVE细胞分裂的活力。
实施例7硫酸新霉素抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子诱导血管生成的活力血管增生是一个持续的不间断的复杂过程。其中，血管内皮细胞的生长起着关键的作用。实施例3和4证明了硫酸新霉素有效地抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子在血管内皮细胞中的核转移以及刺激细胞分裂的活力。所以，本实施例测定了硫酸新霉素抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子诱导血管生成的活力。
血管增生在受精鸡蛋绒毛膜上进行(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，AldermanEM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL.Isolation and characterization ofangiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry1985；24(20)5480-6.)。血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子的上样量为每个鸡蛋10纳克(ng)。不同数量的硫酸新霉素和血管生成因子预先混合，在塑料薄片上风干以后，到置于孵化9天、割口暴露的绒毛膜上。在37摄氏度保温48-72小时后，在显微镜下观察新生血管的形成以决定样品是否有活力。
表1显示硫酸新霉素强烈抑制血管生成素刺激血管新生的活力。酸性及碱性成纤维生长因子刺激血管新生的活力也被硫酸新霉素有效地抑制，但是不如血管生成素那么敏感。血管生成素对硫酸新霉素的高敏感性和实施例3与4的结果是一致的。
表1硫酸新霉素抑制血管生成
实施例8新霉胺抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子诱导血管生成的活力新霉胺(Neamine)，也即新霉素A，是新霉素B和C的降解产物(Leach BE，Teeters CM.Neamine，an antibacterial degradation product of neomycin.J Am Chem Soc1951，722794-2797)。它可以从新霉素在酸性甲醇中经回流合成(Ford HJ，Bergy ME，Brooks AA，Carrett ER，Alberti J，Dyer JR，Carter HE.Further Characterization of Neomycin B and Neomycin C.J Am Chem Soc1955，775311-5314)。新霉胺对肾脏和对听觉神经的毒性要分别低30和20倍。如果新霉胺也能如新霉素一样抑制血管生成因子诱导血管新生的活力，在肿瘤治疗上应该更具优越性。本实施例证明了新霉胺和新霉素同样有效地抑制血管生成素诱导血管新生的活力。更有意义的是新霉胺抑制酸性及碱性成纤维生长因子诱导血管新生的活力比新霉素还高。
具体实施方法如实施例7所述。表2显示了20纳克新霉胺能基本上抑制10纳克血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子诱导血管生成的活力。所以，本发明的一个优选例是新霉胺和2-甲氧基雌二醇的混合使用抑制肿瘤的生长。
表2新霉胺抑制血管生成
实施例9硫酸新霉素抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长为了证明硫酸新霉素的抗肿瘤作用，进行了如下的动物实验。无胸腺小鼠(裸鼠)因为免疫缺陷，外源肿瘤细胞能在其身上建立并快速生长。在肿瘤生长抑制剂的处理下，肿瘤生长速度下降，停止或不发生。
具体方法为一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。每组8个裸鼠，共3组。第1组用生理盐水处理。第2组用每公斤体重20毫克硫酸新霉素皮下注射，注射位点在肿瘤细胞接种点附近。第三组每公斤体重20毫克硫酸新霉素腹腔注射。观察方法为每天观察触摸，用游标卡尺测定肿瘤体积。
如图5所示，裸鼠经人结肠腺癌细胞HT-29结种后，所有动物都长肿瘤并导致最终死亡。在每天皮下或腹腔注射硫酸新霉素处理下，约有一半动物没有长上肿瘤。结果表明，硫酸新霉素有很好的抗癌活力。
实施例102-甲氧基雌二醇抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长由于2-甲氧基雌二醇抑制酸性及碱性成纤维生长因子的核转移从而抑制它们诱导的血管内皮细胞分裂和血管新生，本实施例检测了2-甲氧基雌二醇抑制肿瘤生长的活力。
具体方法与实施例9所述相似。每个裸鼠皮下注射一万个HT-29人结肠腺癌细胞，接着每天皮下注射每公斤体重1毫克2-甲氧基雌二醇。结果如图6所示，大约40％动物没有长上肿瘤。所以，2-甲氧基雌二醇也有很好的抗癌活力。
实施例112-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素混合物抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长实施例9和10表明硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇分别使用都具有较强的抗癌活力。由于它们分别抑制血管生成素和酸性及碱性成纤维生长因子的核转移及其诱导的血管新生，本实施例检测了二者联合使用的抗癌活力。具体方法如实施例9和10诉述，一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。接着每天皮下注射硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇的混合物。混合物的剂量为每公斤体重1毫克2-甲氧基雌二醇、20毫克硫酸新霉素。
如图7所示，动物经过这样的处理，在8个裸鼠中，只有1个长上肿瘤，而且，肿瘤体积要比对照组(单单用生理盐水处理)小得多。结果显示，硫酸新霉素还2-甲氧基雌二醇的抗癌作用有加和效应，抗肿瘤效果达到90％。
实施例12人乳腺癌和肝癌细胞对2-甲氧基雌二醇和硫酸新霉素混合物的高敏感性如上所述，血管生成和多种实体肿瘤和白血病都有密切关系。所以，硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇的混合物应该对包括实体肿瘤和白血病在内的和血管生成一个的疾病都有治疗效果。这一疗效是基于它们抑制血管生成因子在血管内皮细胞内的核转移的活力。到目前为止，还没考虑到硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇对肿瘤细胞本身生长的影响。由于肿瘤细胞分泌大量的血管生成因子，而这些因子由是较为广谱的生长因子，所以，除了抑制血管内皮细胞的生长外，硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇也可能直接抑制肿瘤细胞的生长。因为2-甲氧基雌二醇是雌二醇(避孕药)的生理代谢生物，本实施例检测了硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇对乳癌细胞的专一性。
具体方法为人结肠腺癌细胞HT29，人前列腺癌细胞PC3，人子宫颈癌细胞HeLa，人神经胶质瘤细胞SW1088，人乳腺癌细胞MCF7和人肝癌细胞HepG2培养在含有10％FBS的DMEM中24小时，用无血清DMEM洗三次后，加入100μM的硫酸新霉素和0.2mM的2-甲氧基雌二醇混合物。对照组只加DMEM。继续培养48小时后，收集细胞，用COULTER计数仪测定细胞数。
结果如图8所示，硫酸新霉素和2-甲氧基雌二醇的混合物对抑制多种肿瘤细胞生长都有效，尤其对抑制乳癌和肝癌细胞的生长特别有效。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于，它含有(a)治疗有效剂量的2-甲氧基雌二醇及其类似物，(b)治疗有效剂量的硫酸新霉素及其类似物，以及药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，2-甲氧基雌二醇及其类似物的有效剂量为每日每公斤体重0.1-50毫克。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，硫酸新霉素及其类似物的有效剂量为每日每公斤体重1-60毫克。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过以下形式给药口服、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、腹膜注射和皮下注射。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的2-甲氧基雌二醇及其类似物选自下组2-甲氧基雌二醇，2-乙氧基雌二醇，α-雌二醇，β-雌二醇，2-甲氧基雌二酮，2-乙氧基雌二酮，或其混合物。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的硫酸新霉素及其类似物包括新霉素A(新霉胺)，新霉素B，新霉素C，或其混合物。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗由于血管增生过度所致的人体疾病，所述疾病包括a)肿瘤的生长及转移，所述的肿瘤选自下组肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤；b)与血管增生过度有关的疾病，该疾病选自下组风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
8.2-甲氧基雌二醇及其类似物的用途，其特征在于，用于制备治疗由于血管增生过度所致的人体疾病。
9.硫酸新霉素及其类似物的用途，其特征在于，用于制备治疗由于血管增生过度所致的人体疾病。
10.如权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述的疾病选自乳癌和肝癌。
全文摘要
本发明提供了2－甲氧基雌二醇，硫酸新霉素及其混合物在抑制血管生成因子核转移方面的用途。动物实验证明2－甲氧基雌二醇，硫酸新霉素单独作用能抑制人体肿瘤在裸鼠上的生长，而二者混合使用效果更佳。本发明还提供了含有2－甲氧基雌二醇和硫酸新霉素的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK1452970SQ02111499
公开日2003年11月5日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者胡国富 申请人:上海福缘生化药学研发有限公司