专利名称：大观霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测大观霉素残留量的试剂盒，特别是检测肌 肉、肝脏中大观霉素残留量的酶联免疫试剂盒。 ( 二 )背景技术大观霉素是氨基糖苷类抗生素，主要通过作用于细菌核糖体30S 亚基来抑制其蛋白质的合成，对革兰阴性菌(如大肠埃希菌、沙门菌、布鲁菌、变形菌、铜绿 假单胞菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰阳性菌和支原体亦有一定作用。我国兽药典兽 药使用指南(化学药品巻，2005版)及美国FDA均规定本品在牛、羊、猪、鸡等食用组织中最 高允许残留量分别为肌肉500/zg/kg ;脂肪、肝2000/zg/kg和肾5000/zg/kg。 目前主要有高效液相色谱法、反相高效液相色谱法、微生物学方法等，但是，这些
方法即缺乏必要的灵敏度，亦有繁杂的衍化过程，缺乏特异性等，难以推广应用。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的大观霉 素残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技 术含量不高，可进行一次连续多个样品中大观霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要 的时间。 本实用新型的技术方案是一种检测动物源性食品中大观霉素残留量的酶联免疫 试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶 位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯试剂板作为 固相载体，酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被大观霉素偶联抗原制成 检测板，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将放入真空铝箔袋中，将 6瓶lml梯度浓度的标准品溶液、lml高浓度标准品溶液、7ml酶标二抗、10ml大观霉素抗体 工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml浓縮洗涤液、50ml浓縮复溶液试 剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板 膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的 试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将 板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果 的准确性。检测时，样本中的大观霉素将和酶标板微孔条上预包被的大观霉素偶联抗原竞 争抗大观霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含大观霉 素的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中大观霉 素残留量，其操作简便易行。 经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度肌肉、肝脏样本的最低检测限均为 10ii g/kg ;肌肉、肝脏样本的回收率为85% ±15% ;相对于其他大观霉素检测方法，本试剂 盒所需仪器较少，只需要酶标仪、振荡器、均质器和微量加样器，同类实验室一般均有配备， 所需成本较低。 本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于大观霉素残留量的检
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm); 图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm); 图3为本实用新型酶联板的俯视图； 图4为本实用新型盖板膜平面图； 图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图； 图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图； 图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。 参见附图酶标反应微孔条(2)预包被大观霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外 框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温 箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓縮 洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓縮复溶液；白色帽(6)的白色塑 料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml 显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试 剂瓶(8)用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装10ml大观霉素抗 体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装lml/瓶的标准品溶液及lml高浓度标 准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓縮洗涤液瓶位(18)， 50ml浓縮复溶液(11) ， 7ml显色液A液瓶位(14) ， 7ml显色液B液瓶位(13) ， 7ml终止液瓶 位(12) ， 10ml大观霉素抗体工作液瓶位(16) ，7ml酶标二抗瓶位(15) ，6种lml/瓶各种浓 度的标准品溶液及1瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式本实用新型的实施例 —、样本的前处理 1.配液 配液1 :1%三氯乙酸-0.0謹磷酸盐缓冲液 称取10. 0g三氯乙酸、4. 0g氯化钠、0. lg氯化钾、0. lg磷酸二氢钾、2. 68g十二水
合磷酸氢二钠加去离子水溶解定容至1L。 配液2:复溶工作液 用去离子水将2X浓縮复溶液按1 : 1体积比进行稀释(1份2X浓縮复溶液+1
份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4t:环境可保存一个月。 配液3 :洗涤工作液 用去离子水将20X浓縮洗涤液按1 : 19体积比进行稀释(1份20X浓縮洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4t:环境可保存一个月。 2.以大观霉素标准品添加的肌肉、肝脏样本处理步骤 用均质器均质组织样本；称取2. 0±0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入 10ml lX三氯乙酸-0.01M磷酸缓冲液，用振荡器振荡5min ;3000g以上，室温(20-25。C )离 心5min ;移取200 y 1上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，加入200 y 1复溶工作液充分混匀 (pH值在5 7);取20 iil用于分析。[0027] 二、使用试剂盒的操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种液 体试剂使用前均须摇匀。 2、取出板架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗涤液在使用前也需要回温。 4、编号将样本溶液和标准品工作液对应微孔按序编号，每个样品溶液和标准品 工作液做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。 5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液20 ii 1到各自的微孔 中，随即加入酶标二抗50ia，然后加抗体工作液80ia/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板， 37。C环境中反应30min。 6、取出微孔板，甩出孔内液体，用洗涤液按250iil/孔洗板4-5次，每次浸泡10 秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头剌破)。 7、显色每孔先加入底物液A液50 iU，再加B液50 y 1，轻轻振荡混匀，37。C环境 中避光显色15min。 8、测定每孔加入终止液50 ii 1，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD (若无酶标仪，则不加终止液用 目测法可进行判定)。 三、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与大观霉素残留量成负相关。 1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(P g/L)。 假设样本1的吸光度值为0. 113，样本2的吸光度值为0. 554，标准液吸光度值分别是 0 y g/L为1. 519 ; 1 ii g/L为1. 200 ;2 ii g/L为0. 850 ;4 ii g/L为0. 436 ;8 ii g/L为0. 186 ; 16 y g/L为0. 079。则样本1的浓度范围是8 ii g/L-16 y g/L乘以其对应的稀释倍数；样本 2的浓度范围是2 ii g/L-4 ii g/L乘以其对应的稀释倍数。 2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，艮卩
B
百分吸光度值(％) = - x 100%
BO B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0-0 ii g/L标准溶液的平均吸光度值 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以大观霉素标准品浓度(P g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应 的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中大观霉素实际残留量。 四、测定前的注意事项 1、室温低于2(TC或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的OD值偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性
不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、每加一种试剂前需要将其摇匀。 4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中 的试剂。 6、储存条件 保存试剂盒于2-8 °C ，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 7、试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长 反应时间，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
权利要求一种检测动物源性食品中大观霉素残留量的酶联免疫试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被大观霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用白色帽 的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料 瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液 用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓縮洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓縮复溶液用蓝色帽 的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔 预包被大观霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，lml/ 瓶，浓度分别为0 ii g/L， 1 ii g/L， 2 ii g/L， 4 ii g/L， 8 y g/L， 16 y g/L ;高浓度标准品溶液1瓶， lml ;酶标二抗1瓶，7ml ;抗体工作液1瓶，10ml ;显色液A液1瓶，7ml ;显色液B液1瓶， 7ml ;终止液1瓶，7ml ;浓縮洗涤液1瓶，40ml ;浓縮复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中大观霉素残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、大观霉素抗体工作液、大观霉素6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被大观霉素偶联抗原，样本中含有的大观霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗大观霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中大观霉素的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在肌肉、肝脏中大观霉素的残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201535774SQ200920246850
公开日2010年7月28日 申请日期2009年11月11日 优先权日2009年11月11日
发明者万宇平, 何勇, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 冯静, 刘福林, 汤庆彩, 汪善良, 王立志, 赵正苗, 郝士元 申请人:北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司