专利名称：用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法。
背景技术：
生物膜是微生物治理环境污染的重要方法之一，可应用于各种工业企业的污水处理场和市政污水处理场所采用的生物滤池和各种工业或生活产生废气的处理塔或处理池。
用生物膜进行废气或污水污染控制是目前国内外研究热点也是发展方向，迄今该领域研究中存在的主要问题是生物膜的菌群组成和空间结构在线快速检测，即生物膜的解析，一般均以“暗箱”模式进行各种工艺研究及优化，故难以揭示菌群构成与生物膜处理效果之间关系，从而影响对该工艺进行本质的优化，达不到最好的效果。
目前部分研究对生物膜内部的菌群情况采用MPN(Maximum PossibleNumber)方法计数，费时而且需离线进行。另有采用荧光原位杂交FISH(fluorescence in situ hybridization)方法和PCR分子鉴定方法分析活性污泥中特定细菌(如硝化细菌)数目。FISH方法MPN方法有很大进步，但仍须进行以荧光标记探针杂交操作后方可进行荧光观察。PCR方法需要核酸提取，PCR反应和凝胶电泳鉴定。这些方法存在以下缺点破坏了生物膜的完整性；操作复杂；实时性差。
(三)
发明内容
本发明既是为了提供一种解析过程简单快捷、对生物膜无破坏性且实时性好的用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种用于构造生物膜的成膜菌剂，所述的成膜菌剂菌株用有色荧光蛋白基因标记。
所述的成膜菌为大肠菌群或硝化细菌之一或其混合物，所述的不同种的成膜菌标记不同色的荧光蛋白基因标记。
所述成膜菌也可为单一菌种，所述有色荧光蛋白为绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
用所述的成膜菌剂构造生物膜。
所述的构造生物膜的方法为成膜菌剂菌株用荧光蛋白基因标记后，获得的标记菌株与生物填料在氨苄含量为20～150μg/mL的培养基中、20～50℃下共混培养1～8天得到所述的生物膜。
所述的成膜菌剂菌株为大肠菌群或硝化细菌之一或其混合。
所述的生物填料为火山岩或多孔碳颗粒。
所述的方法如下有色荧光蛋白基因经CaCl2或电穿孔法转化标记成膜菌剂菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为20～150μg/mL的培养基、与生物填料在20～50℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
具体的，所述的方法如下绿色荧光蛋白基因pEGFP经CaCl2转化法标记大肠杆菌菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为50～150μg/mL的培养基、在摇瓶中与火山岩颗粒在30～45℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
或者，所述的方法如下绿色荧光蛋白基因pEGFP经电穿孔法转化标记硝化杆菌菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为50～150μg/mL的培养基、在摇瓶中与多孔碳颗粒在30～45℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
所得生物膜的解析方法如下用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩或者多孔碳填料生物膜选定区域不同层面的图片堆，比如选取250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片经COMSTAT程序处理便可以获得生物膜定量化参数，如生物膜平均厚度、最大厚度、生物膜表面积及生物膜比表面积等，用以表征生物膜的空间结构特征。
本发明所述的用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法的有益效果主要体现在(1)可保证生物膜不被破坏的情况下进行解析，达到原位分析的目的；(2)生物膜解析过程中不需对生物膜中微生物细菌进行培养计数或提取细菌细胞的核酸进行杂交或电泳等鉴定分析，操作简单方便；(3)生物膜的解析在线进行，实时性好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述实施例1绿色荧光蛋白基因载体pEGFP经CaCl2转化法标记大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与火山岩颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(37℃，120r/min，1天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理获得相关的定量化参数1天生物膜平均厚度为0.120844μm，生物膜最大厚度为10.5μm，单位面积的生物膜体积为0.136986μm3/μm2，生物膜表面积21338.1μm2，生物膜比表面积为3.36854μm2/μm3。
实施例2绿色荧光蛋白基因载体pEGFP经电穿孔转化法标记大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含150μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(37℃，120r/min，1天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理获得相关的定量化参数1天生物膜平均厚度为0.110685μm，生物膜最大厚度为9.1μm，单位面积的生物膜体积为0.116928μm3/μm2，生物膜表面积18982.3μm2，生物膜比表面积为3.05456μm2/μm3。
实施例3绿色荧光蛋白基因载体pEGFP经CaCl2转化法标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与火山岩颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(30℃，120r/min，7天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数，7天生物膜平均厚度为0.121085μm，生物膜最大厚度为11.2μm，单位面积的生物膜体积为0.198646μm3/μm2，生物膜表面积21338.1μm2，生物膜比表面积为4.36854μm2/μm3。
实施例4绿色荧光蛋白基因载体pEGFP经电穿孔法转化标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(30℃，120r/min，7天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数，7天生物膜平均厚度为0.132148μm，生物膜最大厚度为12.6μm，单位面积的生物膜体积为0.263966μm3/μm2，生物膜表面积30513.7μm2，生物膜比表面积为4.98865μm2/μm3。
实施例5黄色荧光蛋白基因载体pEYFP经CaCl2转化法标记大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(25℃，120r/min，5天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数，5天生物膜平均厚度为0.128365μm，生物膜最大厚度为11.9μm，单位面积的生物膜体积为0.213586μm3/μm2，生物膜表面积28945.5μm2，生物膜比表面积为4.43568μm2/μm3。
实施例6蓝色荧光蛋白基因载体pECFP经电穿孔法转化标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(45℃，120r/min，3天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数，3天生物膜平均厚度为0.120336μm，生物膜最大厚度为10.2μm，单位面积的生物膜体积为0.168795μm3/μm2，生物膜表面积20568.6μm2，生物膜比表面积为3.98465μm2/μm3。
实施例7红色荧光蛋白基因载体pDsRed 2-1经CaCl2转化法标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株作为模式细菌以5环/瓶的接种量接种含50μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与火山岩颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(35℃，120r/min，6天)。用激光共聚焦扫描显微镜摄取获得火山岩填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理可以获得相关的定量化参数，6天生物膜平均厚度为0.121085μm，生物膜最大厚度为12.2μm，单位面积的生物膜体积为0.184567μm3/μm2，生物膜表面积20391.6μm2，生物膜比表面积为4.29654μm2/μm3。
实施例8绿色荧光蛋白基因载体pEGFP经电穿孔转化法标记大肠杆菌Escherichia coii JM109菌株，红色荧光蛋白基因载体pDsRed经电穿孔法转化标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株分别作为模式细菌以2环/瓶的接种量接种含150μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(37℃，120r/min，7天)。用激光共聚焦扫描显微镜以不同激发光(480nm和580nm)分别摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理获得相关的定量化参数7天生物膜(绿色)平均厚度为0.15285μm，生物膜最大厚度为12.5μm，生物膜体积为0.13198μm3，生物膜表面积209882.3μm2，生物膜比表面积为3.55561μm2/μm3。7天生物膜(红色)平均厚度为0.10165μm，生物膜最大厚度为8.2μm，生物膜体积为0.09692μm3，生物膜表面积13256.3μm2，生物膜比表面积为2.00446μm2/μm3。
实施例9黄色荧光蛋白基因载体pEYFP经电穿孔转化法标记大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株，蓝色荧光蛋白基因载体pECFP经电穿孔法转化标记硝化杆菌Nitrobacter sp.N-20菌株，获得的标记菌株分别作为模式细菌以2环/瓶的接种量接种含150μg/mL氨苄的LB培养基50mL/瓶，在摇瓶中与多孔碳颗粒(5g/瓶)共混培养挂膜(37℃，120r/min，7天)。用激光共聚焦扫描显微镜以不同激发光(520nm和440nm)分别摄取获得多孔碳填料生物膜250×250μm区域不同层面的图片堆，所获图片堆经COMSTAT程序处理获得相关的定量化参数7天生物膜(蓝色)平均厚度为0.13525μm，生物膜最大厚度为11.5μm，生物膜体积为0.12388μm3，生物膜表面积189823.1μm2，生物膜比表面积为3.23555μm2/μm3。7天生物膜(黄色)平均厚度为0.11625μm，生物膜最大厚度为7.9μm，生物膜体积为0.10628μm3，生物膜表面积128326.1μm2，生物膜比表面积为2.20656μm2/μm3。
权利要求
1.一种用于构造生物膜的成膜菌剂，其特征在于所述的成膜菌剂菌株用有色荧光蛋白基因标记。
2.如权利要求1所述的用于构造生物膜的成膜菌剂，其特征在于所述的成膜菌为大肠菌群或硝化细菌之一或其混合物，所述的不同种的成膜菌标记不同色的荧光蛋白基因标记。
3.如权利要求1所述的用于构造生物膜的成膜菌剂，其特征在于所述成膜菌为单一菌种，所述有色荧光蛋白为下列之一①绿色荧光蛋白 ②黄色荧光蛋白③红色荧光蛋白 ④蓝色荧光蛋白。
4.用如权利要求1所述的成膜菌剂构造生物膜。
5.如权利要求4所述的构造生物膜的方法为成膜菌剂菌株用荧光蛋白基因标记后，获得的标记菌株与生物填料在氨苄含量为20～150μg/mL的培养基中、20～50℃下共混培养1～8天得到所述的生物膜。
6.如权利要求4所述的构造生物膜的方法，其特征在于所述的生物填料为火山岩或多孔碳颗粒。
7.如权利要求4～6所述的构造生物膜的方法，其特征在于所述的方法如下有色荧光蛋白基因经CaCl2或电穿孔法转化标记成膜菌剂菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为20～150μg/mL的培养基、与生物填料在20～50℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
8.如权利要求7所述的构造生物膜的方法，其特征在于所述的方法如下绿色荧光蛋白基因pEGFP经CaCl2转化法标记大肠杆菌菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为50～150μg/mL的培养基、在摇瓶中与火山岩颗粒在30～45℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
9.如权利要求5所述的构造生物膜的方法，其特征在于所述的方法如下绿色荧光蛋白基因pEGFP经电穿孔法转化标记硝化杆菌菌株，获得的标记菌株接种氨苄含量为50～150μg/mL的培养基、在摇瓶中与多孔碳颗粒在30～45℃下共混培养1～8天即得到所述的生物膜。
10.用如权利要求1所述的成膜菌剂构成生物膜的解析方法，其特征在于所述的方法是用激光共聚焦扫描显微镜摄取所述生物膜选定区域不同层面的图片堆，所获图片经COMSTAT程序处理便可得到生物膜定量化参数。
全文摘要
本发明提供了一种用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法。所述的成膜菌剂菌株用有色荧光蛋白基因标记。本发明所述的用于构造生物膜的成膜菌剂及其构造和解析生物膜的方法的有益效果主要体现在(1)可保证生物膜不被破坏的情况下进行解析，达到原位分析的目的；(2)生物膜解析过程中不需对生物膜中微生物细菌进行培养计数或提取细菌细胞的核酸进行杂交或电泳等鉴定分析，操作简单方便；(3)生物膜的解析在线进行，实时性好。
文档编号C12N1/00GK1644674SQ20041009306
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者钟卫鸿, 陈建孟, 叶海仁, 汪琨, 宋艳绒, 路争 申请人:浙江工业大学