专利名称：一种检测牛乳中沙门氏菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测牛乳中细菌的方法。
技术背景沙门氏菌属于人畜共患病原菌，是世界卫生组织(WHO)所列最主要的食 源性病原细菌。沙门氏菌不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、 败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒 病例居于前列。2003年WHO的一份报告中指出"虽然在欧洲的一些国家中 沙门氏菌的致病率呈下降趋势，但沙门氏菌在所有由食源性致病菌引起的病例 中占有75%,这说明了沙门氏菌仍然是引起食物中毒的最常见的食源性致病 菌。沙门氏菌作为致病菌检测的一项重要指标，在食品安全特别是乳品安全检 验检疫中是必需检测的项目，有重要的社会、经济的意义。传统的沙门氏菌的 检测常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告， 确诊检验结果至少需5 7天。这些传统的沙门氏菌检验方法存在繁琐、费时费 力、特异性低的缺陷。LAMP技术的全称是环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification),是2000年由日本学者Notomi等发明一种新型的基因扩增技 术。LAMP技术利用特异性引物(4种)和两个辅助引物，以识别耙基因的六 个特定区域。反应在等温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应 极快， 一般在一小时内完成；扩增产生的产物量大，肉眼、电泳或比浊仪均可 判度结果；灵敏度高、特异性强，极适于病原菌检测。目前针对食源性致病菌的基因检测技术(如PCR技术或LAMP技术)的 检测第一步大都采用预增菌来获得足够的菌体，在预增菌步骤后再进行PCR 检领!l，能够达到很低的检测限；但预增菌步骤一般需要8~12h，无形中就增加 了一个工作日的检测时间，增加了检测时间及检测成本。如果不预增菌直接进 行PCR或LAMP检测食品样品其检测灵敏度均不理想。
随着我国经济的快速增长和乳品行业的蓬勃发展，牛乳已经成为百姓生活 中必不可少的营养食品，牛乳的食用安全性也备受重视。但是现在没有一种可 以快速检测牛乳中沙门氏菌的方法。发明内容本发明的目的是为了解决传统的沙门氏菌检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低的缺陷及现有的PCR技术或LAMP技术必需预增菌，无法快速检测 牛乳的问题，而提供的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法。检测牛乳中沙门氏菌的方法按以下步骤进行 一、被检测牛乳脱脂；二、 按脱脂牛乳与EDTA溶液6~8 : 1的体积比向脱脂牛乳中加入质量浓度为 400/。 60。/。的EDTA溶液，然后在37士1。C条件下水浴40 50min;三、过滤无 菌操作；四、用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌，然后离心洗脱液，再弃去上清 液，并用lmLTE溶液重新悬浮沉淀物，之后再次离心、弃去上清液，用细菌 基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品DNA;五、LAMP扩增25jiL 扩增体系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 l|iL浓度为1.4mM的dNTP、 1.6pL 浓度为25]tiM的FIP引物、1.6iiL浓度为25pM的BIP引物、0.8iaL浓度为25pM 的F3引物、0.8|aL浓度为25nM的B3引物、0.4pL浓度为25pM的Loop f 引物、0.4pL浓度为25pM的loopb引物、5jiL样品DNA、 0.5pLBst聚合酶 和10.4pL灭菌超纯水组成，扩增条件为65。C扩增60min;六、鉴定取LAMP 扩增产物5pL，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶，再以100V电压在lxTAE 电泳缓冲液中电泳45min，然后在凝胶成像系统中成像；其中步骤六使用的琼 脂糖凝胶中含有0.25jig/mL的溴化乙啶。本发明方法简单、省时，检测操作仅需约3小时(对原料乳的初处理至分 析鉴定完毕，全部流程可以控制在6.5h以'内)，大大的提高了被检牛乳产品的 新鲜度和货架期；而且本发明方法不需要预增菌，具有快速灵敏的优点。本发 明克服了现有技术无法采用过滤法直接对牛乳中沙门氏菌进行快速富集检测 的缺陷。本发明方法利用螯合剂EDTA对二价金属离子具有螯合作用，可以夺 取酪蛋白胶束中的Ca2、使酪蛋白胶束解离成小分子酪蛋白单体，从而克服了 牛乳酪蛋白胶束在快速过滤富集过程中的阻遏作用，达到过滤直接快速富集检 测沙门氏菌。 本发明方法利用沙门氏菌特异性引物，采用优化的LAMP反应系统，成功 地以沙门氏菌Mv4基因为靶基因进行扩增，特异性强，准确率高达99.6%。
图1是具体实施方式
十一检测结果的凝胶电泳图。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式检测牛乳中沙门氏菌的方法按以下步骤进 行 一、被检测牛乳脱脂；二、按脱脂牛乳与EDTA溶液6 8 : 1的体积比向 脱脂牛乳中加入质量浓度为40%~60%的EDTA溶液，然后在37土rC条件下水 浴40 50min;三、过滤无菌操作；四、用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌， 然后离心洗脱液，再弃去上清液，并用lmLTE溶液重新悬浮沉淀物，之后再 次离心、弃去上清液，用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品 DNA;五、LAMP扩增25jaL扩增体系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 1 pL浓 度为10mM的dNTP、 1.6pLFIP引物、1.6pLBIP引物、0.8pLF3引物、0.8nL B3引物、0.4juL Loop f弓l物、0.4pL loop b引物、5pL样品DNA、 0.5pL Bst 聚合酶和10.4iiL灭菌超纯水组成，扩增条件为65'C扩增60min;六、鉴定 取LAMP扩增产物5^L，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶，再以100V电 压在lxTAE电泳缓冲液中电泳45min，然后在凝胶成像系统中成像；其中步 骤六使用的琼脂糖凝胶中含有0.25pg/mL的溴^^乙啶。本实施方式步骤五中使用的聚合酶购自于美国New England Biolabs (NEB) 公司。本实施方式扩增结果无条带表明被检测牛乳中无沙门氏菌或被检测牛乳 中沙门氏菌含量低于检出限(10QcfU/mL);扩增结果出现梯形条带表明被检测 牛乳中有沙门氏菌。本实施方式步骤五中 loop f 引物的序列为 CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC ; loop b 引物的序列为 AAGGGAAAGCCAGCTTTACG ; FIP 引 物 的 序 列 为 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序序列为 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 引物的序列为 GATGCCGGC AATAGCGTC 。
本实施方式步骤三过滤前需要对过滤膜进行检查，避免过滤膜有空隙、裂 纹或漏气。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一被检测牛乳在2800 3200g的条件下离心10 20min，然后真空抽取上层脂肪进行脱 脂。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤一被检测牛乳在3000g的条件下离心15min，然后真空抽取上层脂肪进行脱脂。其它 步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中按脱脂牛乳与EDTA溶液7 : 1的体积比加入质量浓度为50%的EDTA溶液。其 它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中在37"C条件下水浴45min。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中采用真空抽滤。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式采用真空抽滤，细菌与过滤膜之间的结合力小，更容易被冼脱 下来。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤三中过滤膜的孔径为0.22pm。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中洗脱液在10000g的条件下离心5min。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中悬浮的沉淀物在10000g的条件下离心5min。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤四中用20mL生理盐水洗脱过滤膜上的细菌。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
十一本实施方式检测牛乳中沙门氏菌的方法按以下步骤进 行 一、被检测牛乳脱脂取M0mL被检测牛乳在3000g的条件下离心i5min， 然后真空抽取上层脂肪进行脱脂；二、按脱脂牛乳与EDTA溶液6.5 : 1的体 积比向脱脂牛乳中加入质量浓度为50%的EDTA溶液，然后在37。C条件下水
浴45min;三、过滤无菌采用真空抽滤操作，过滤膜的孔径为0.22pm;四、 将过滤膜粉碎成小块，然后用20mL生理盐水在漩涡振荡器上洗脱过滤膜上的 细菌，然后在10000g的条件下离心洗脱液5min，再弃去上清液，并用lmLTE 溶液重新悬浮沉淀物，之后再次在lOOOOg的条件下离心5min、弃去上清液， 用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品DNA;五、LAMP扩增 25|iL扩增体系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 lpL浓度为1.4mM的dNTP、 1.6pL浓度为25pM的FIP引物、1.6piL浓度为25pM的BIP引物、0.8^L浓 度为25jiM的F3引物、0.8pL浓度为25pM的B3引物、0.4pL浓度为25^M 的Loopf引物、0.4iaL浓度为25^M的loop b引物、5pL样品DNA、 0.5jaLBst 聚合酶和10.4nL灭菌超纯水组成，扩增条件为65r扩增60min;六、鉴定 分别取4组LAMP扩增产物，每组LAMP扩增产物10pL点样于质量浓度为 2%的琼脂糖凝胶，并以100bpDNAMarker作为标准分子参照，再以100V电 压在lxTAE电泳缓冲液中电泳45min，然后在凝胶成像系统中成像；其中步 骤六使用的琼脂糖凝胶中含有0.25|ig/mL的溴化乙啶。本实施方式的凝胶电泳检测结果如图1所示，检测结果证明本实施方式方 法准确率高、稳定性好、可重复性强。本实施方式步骤六中使用的凝胶成像系统为美国的UVP凝胶成像系统。 本实施方式步骤五中loopf引物的序列为 CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC ;loopb引物的序歹!]为 AAGGGAAAGCCAGCTTTACG; FIP 引物的序列 为 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序序歹U为 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 引物的序列为 GATGCCGGC AATAGCGTC 。 序列表〈110>东北农业大学〈120〉 一种检测牛乳中沙门氏菌的方法〈160〉 6〈210〉 1 〈211〉 24 〈212〉醒 〈213>人工序列〈220〉〈223〉根据沙门氏菌的i/7^l基因设计的loop f引物。 〈400〉 1cggccttcaa atcggcatca atac 24〈210〉 2 <211> 20 〈212〉腿 <213>人工序列〈220>〈223〉根据沙门氏菌的i/7^基因设计的loop b引物。 〈400〉 2aagggaaagc cagctttacg 20〈210> 3 <211〉 40 <212> DNA
〈213〉人工序列 〈220〉〈223>根据沙门氏菌的i"W基因设计引物的FIP引物。 〈400> 3gcgcggcatc cgcatcaata atggtatgcc cggtaaacag 40〈210〉 4 ,〈211> 38〈212〉 DNA 〈213>人工序列〈220>〈223〉根据沙门氏菌的i/7^基因设计的BIP引物。 〈400> 4gaacggcgaa gcttactgga catcgcaccg tcaa鄉a 38〈210> 5 〈211〉 18 <212>腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223>根据沙门氏菌的i"W基因设计的F3引物。 〈400〉 5cggcccgatt ttctctgg 18 '〈210〉 6 〈211> 18
〈212>腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据沙门氏菌的i/7^基因设计的B3引物。 〈400〉 6gatgccggca atagcgtc 18
权利要求
1、一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于检测牛乳中沙门氏菌的方法按以下步骤进行一、被检测牛乳脱脂；二、按脱脂牛乳与EDTA溶液6～8∶1的体积比向脱脂牛乳中加入质量浓度为40％～60％的EDTA溶液，然后在37±1℃条件下水浴40～50min；三、过滤无菌操作；四、用生理盐水洗脱过滤膜上的细菌，然后离心洗脱液，再弃去上清液，并用1mL TE溶液重新悬浮沉淀物，之后再次离心、弃去上清液，用细菌基因组DNA提取试剂盒快速提取被检测样品DNA；五、LAMP扩增25μL扩增体系由2.5μL 10×ThermoPolBuffer、1μL浓度为1.4mM的dNTP、1.6μL浓度为25μM的FIP引物、1.6μL浓度为25μM的BIP引物、0.8μL浓度为25μM的F3引物、0.8μL浓度为25μM的B3引物、0.4μL浓度为25μM的Loop f引物、0.4μL浓度为25μM的loopb引物、5μL样品DNA、0.5μL Bst聚合酶和10.4μL灭菌超纯水组成，扩增条件为65℃扩增60min；六、鉴定取LAMP扩增产物5μL，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶，再以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳45min，然后在凝胶成像系统中成像；其中步骤六使用的琼脂糖凝胶中含有0.25μg/mL的溴化乙啶。
2、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤一被检测牛乳在2S00 3200g的条件下离心10 20min，然后真空抽取上层 脂肪进行脱脂。
3、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤二中按脱脂牛乳与EDTA溶液7 : 1的体积比加入质量浓度为50%的 EDTA溶液。
4、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤二中在37"C条件下水浴45min。
5、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤三中采用真空抽滤。
6、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤三中过滤膜的孔径为0.22pm。
7、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于步骤四中洗脱液在lOOOOg的条件下离心5min。
8、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤四中用20mL生理盐水洗脱过滤膜上的细菌。
9、 根据权利要求l所述的一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，其特征在于 步骤五中loop f引物的序列为CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC; loop b 引物的序列为AAGGGAAAGCCAGCTTTACG ; FIP引物的序列为 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序 列为GAACGGCGAAGCTTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGA; F3引物的 序歹U为 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 弓l物的序列为 GATGCCGGC AATAGCGTC 。
全文摘要
一种检测牛乳中沙门氏菌的方法，它涉及一种检测牛乳中细菌的方法。它解决了传统的沙门氏菌检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低的缺陷及现有的PCR技术或LAMP技术必需预增菌，无法快速检测牛乳的问题。检测方法一、牛乳脱脂；二、加入EDTA溶液水浴；三、过滤；四、提取样品DNA；五、LAMP扩增；六、鉴定。本发明方法简单、省时，检测操作仅需约3小时，大大的提高了被检牛乳产品的新鲜度和货架期；而且本发明方法不需要预增菌，具有快速灵敏的优点。本发明方法利用沙门氏菌特异性引物，采用优化的LAMP反应系统，成功地以沙门氏菌invA基因为靶基因进行扩增，特异性强，准确率高达99.6％。
文档编号G01N27/447GK101149355SQ200710144578
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者伟 刘, 琦 吕, 姜毓君, 孙大庆, 王明娜, 冰 闫, 韩希妍 申请人:东北农业大学