vA基因序列和沙门 氏菌编码鞭毛抗原的sefA基因序列，所述沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的 invA基因序列和沙门氏菌编码鞭毛抗原的sefA基因序列分别如SEQIDN0. :1和SEQID NO:3所示；
[0055] ②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到沙门氏菌的质粒标准分子。
[0056] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19,pUC18,pUC118,pUC119， pBlueScriptIISK或pGEM。
[0057] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
[0058] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0059] 图1是本发明质粒标准分子pXLlO的图谱。
[0060] 图2是本发明所得质粒标准分子PXL10稳定性检测结果图。
[0061] 图3是利用本发明质粒标准分子pXLlO建立的实时荧光PCR标准曲线。
[0062] 图4是本发明质粒标准分子pXLll的图谱。
[0063] 图5是本发明所得质粒标准分子pXLll稳定性检测结果图。
[0064] 图6是利用本发明质粒标准分子pXLll建立的实时荧光PCR标准曲线。
【具体实施方式】
[0065] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于沙门氏菌PCR检测的多核苷 酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序 列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异 性和灵敏度，并且稳定性良好。而且，配合使用本发明的质粒标准分子PXL10和pXLl1，不仅 能够检测出沙门氏菌，还能够鉴别出致病性的沙门氏菌。
[0066] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的沙门氏菌实时荧光PCR检测方法 中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于沙门氏菌实时荧光PCR检 测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
[0067] 检测菌株
[0068] 沙门氏菌是一种革兰氏阴性病原菌，不仅能导致鸡白痢、鸡伤寒、副伤寒等多种 动物疾病，而且在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒病例占首位。
[0069] invA是编码沙门氏菌的侵袭蛋白的基因，侵袭蛋白基因使细菌具有侵袭宿主上皮 细胞的能力，是只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列；鞭毛是细菌重要的毒力 因子之一，它为细菌的运动提供动力，可以作为在细胞表面的黏附素，决定了细菌在细胞表 面吸附及以后的侵入和定居过程。sefA基因编码沙门氏菌鞭毛的抗原，可以作为检测沙门 氏囷的关键革El基因。
[0070] 实时荧光PCR检测沙门氏菌的原理
[0071] 采用实时荧光PCR技术可特异性扩增沙门氏菌基因组DNA中invA基因序列或沙 门氏菌sefA基因序列，设计针对以上靶基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品 DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同 的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质（或阳性标准分子）。PCR方法中，阳性 标准物质（或阳性标准分子）可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质（或阳性 标准分子）可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对 含量（拷贝数或浓度）。
[0072] 标准物质
[0073] 标准物质是具有一套或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评 价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
[0074] 质粒标准分子
[0075] 本发明中涉及两种检测沙门氏菌的特异性序列并在此基础上设计了两种质粒标 准分子，一种沙门氏菌的特异性序列是沙门氏菌invA基因，长度为2058bp;另一套沙门氏 菌的特异性序列是沙门氏菌sefA基因，长度为498bp。
[0076] 在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一套沙门氏菌的质粒标准分 子，该质粒标准分子包含沙门氏菌invA基因序列，所述沙门氏菌invA基因序列如序列表中 SEQIDNO: 1 所示：
[0079] 本发明的质粒标准分子，较佳地含有沙门氏菌的PCR检测的靶基因沙门氏菌invA 基因序列。
[0080] 本发明中所述的沙门氏菌invA基因，编码沙门氏菌的侵袭蛋白，该基因使细菌具 有侵袭宿主上皮细胞的能力，是只存在于致病性沙门菌中的独特的保守基因序列。所述沙 门氏菌invA基因的序列较佳的如SEQIDN0 :1所示。
[0081] 本发明所述的质粒标准分子的序列较佳的如SEQIDN0 :2所示，其中第414位到 第2471位为invA基因序列：
[0082]
[0085] 在本发明的另一个优选地实施方式中，本发明提供了一套沙门氏菌的质粒标准分 子，该质粒标准分子包含沙门氏菌sefA基因序列，所述沙门氏菌内化素sefA基因序列如序 列表中SEQIDN0 :3所示：
[0087] 本发明的质粒标准分子，较佳地含有沙门氏菌的PCR检测的靶基因沙门氏菌sefA 基因序列。
[0088] 本发明中所述的沙门氏菌sefA基因基因，编码沙门氏菌鞭毛的抗原，它可作为沙 门氏菌检测的一种靶基因，所述沙门氏菌sefA基因的序列较佳的如SEQIDN0 :3所示。
[0089] 在本发明的另一个较佳的实施方式中，本发明所述的质粒标准分子的序列如SEQ IDN0 :4所示，其中第414位到第911位为sefA基因序列：
[0090]
[0092] 在本发明的另一较佳的实施方式中，根据本发明的质粒标准分子中含有沙门氏菌 invA基因序列和沙门氏菌sefA基因序列。较佳地，所述的invA序列如SEQIDN0. :1所 示，所述的sefA序列如SEQIDN0. :3所示。
[0093] 本发明中如上所述沙门氏菌的质粒标准分子的定量方法，其包括以下步骤：
[0094] ①提取质粒标准分子；
[0095] ②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中 的磷元素的含量；
[0096] ③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发 射质谱的标准曲线；
[0097] ④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测质粒标准分子溶液，并根据步骤③所得 的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；
[0098] ⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子 中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。
[0099] 其中步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气流 量较佳地为l〇L/min~25L/min，最佳地为16. 86L/min，辅助气流量较佳地为0. 5L/min~ 3.OL/min，最佳地为0. 88L/min，雾化气流量为较佳地为0. 5L/min~2. 43L/min，更佳地为 1. 123L/min，功率较佳地为1200W~1400W，最佳地为1350W。
[0100] 本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感 耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS)。
[0101] 具体实施说明：
[0102] 本发明所述质粒标准分子的定量方法较佳地包括紫外分光光度法和高分辨电感 耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS)。
[0103] 其中紫外分光光度法对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
[0104] ①提取质粒标准分子；
[0105] ②用TE缓冲液使紫外分光光度计校正为零点；
[0106] ③取适量DNA(根据仪器的需要）至比色杯中（nanodrop直接点在检测区域），记 录仪器读数。
[0107] ④若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光 密度，DNA样品的浓度为0D260X核酸稀释倍数X50,浓度单位为ng/μL。
[0108] (2)HR-ICP-MS对质粒标准分子定量方法较佳地包括以下步骤：
[0109] ①提取质粒标准分子；
[0110] ②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素 的含量；
[0111] ③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线。
[0112] ④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据标准曲线得出质粒标准分子的磷含量。
[0113] ⑤根据质粒标准分子的磷含量计算出质粒标准分子的浓度。
[0114] 本发明还提供了一套沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法，其所采用的标准物质 是如上所述的质粒标准分子。
[0115] 本发明还提供了一套如上所述的沙门氏菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下 步骤：
[0116] ①人工合成所述