Amplification method)法、?及TMA(Transcription mediated amplification method)法等公知的方法，但不限于此。Q-Beta Replicase Amplification Techno logy法、RCA法、NASBA法、SDA法、TMA法、LAMP法、ICAN法等是在一定溫度下进行扩增 反应的方法，其他的PCR法、LCR法等是在溫度循环中进行扩增反应的方法。
[0067] 此外，利用逆转录酶等将RNA逆转录为DNA、W该DNA作为模板采用上述的核酸扩增 方法可W间接地对RNA进行检测。
[0068] 在本发明中，作为染料，可W列举出：=苯基甲烧类染料、嚷嗦类染料、，躁嗦类染 料、叮嗦类染料、吩嗦类染料、夹氧杂蔥类染料、菲晚緣（Phenanthridium)类染料、偶氮类 染料、内醋类染料、横内醋(SUltone)类染料、說青类染料、花青类染料、羊杂菁(oxonol)类 染料、苯乙締型（Styryl)类染料、日h嘟类染料、硫代夹氧杂蔥类染料、方酸鏡盐 (squarainium)类染料、克酬酸（croconium)类染料、azulenium类染料、二硫醇金属盐类染 料、糞酿类染料、蔥酿类染料、說酪(indophenol)类染料、香豆素类染料、香豆素酬类染料、 化喃鑛；盐类染料、硫代化喃錄Jk系、嚷挫类染料、哇嘟类染料、二苯甲酬类染料、硫代二苯 甲酬类染料和它们的混合物。
[0069] 优选为=苯基甲烧类染料、嚷嗦类染料、S敷嗦类染料、叮嗦类染料、吩嗦类染料、 夹氧杂蔥类染料、菲晚纖.类染料、偶氮类染料、說青类染料、内醋类染料、横内醋类染料和 它们的混合物。
[0070] 而且，在本发明中，=苯基甲烧类染料是指具有下述式(I)或式(2):
[0071] [化1]
[0072] (I)
[0073]
[0074]
[0075] (巧
[0076] 表示的结构的染料。
[0077] 运里，R、R'W及R"独立地选自苯基、糞基、蔥基等运样的取代和非取代芳基。芳基 可W用例如氨基、径基、幾基、簇基、横酸、烷基运样的官能基团、和/或其他官能基团进行取 代。
[0078] 对可用于核酸检测的染料没有特殊限制，只要能够与核酸结合即可。在具体的例 子方面，作为S苯基甲烧类染料，可W列举出例如甲基绿、孔雀绿、结晶紫、碱性副品红、龙 胆紫B、龙胆紫R、夜光蓝、维多利亚蓝B、维多利亚蓝R、维多利亚蓝4R、维多利亚蓝B0、玫红 酸、品红、酸性品红、碱性品红、新品红、漠百里酪蓝、漠甲酪绿、酪献、漠酪蓝、专利蓝紫、酪 红、颜料蓝1、颜料紫3、苄基紫、五甲基碱性副品红、固绿FCF、乙基紫、绿S、菩薇苯胺 (rosaniline)、酸性蓝7、天青蓝G、搔洛铭花青R、酸性蓝147、亮绿SF黄、亮绿SF、乙基绿、苯 胺蓝、甲基紫、铭紫CG。
[0079] 作为嚷嗦类染料，可W列举出例如甲苯胺蓝0、亚甲基蓝、硫堇、天青A、硫醇C。
[0080] 作为P恶，嗦类染料，可W列举出例如亮甲酪蓝、尼罗蓝、倍花青、基础蓝3。
[0081] 作为叮嗦类染料，可W列举出例如苯胺黑、乙烘黑等。
[0082] 作为吩嗦类染料，可W列举出例如中性红、詹纳斯绿B、基础红2、番红B。
[0083] 作为夹氧杂蔥类染料，可W列举出例如巧光素、罗丹明、派洛宁Y。
[0084] 作为菲晚.'緣（地enant虹idi皿)类染料，可W列举出例如漠化乙锭。
[0085] 作为偶氮染料，可W列举出例如Bismarck栋、新姻脂红、基础红29。
[0086] 作为說青类染料，可W列举出例如說蓝姻脂红等。
[0087] 对于染料在含核酸的溶液中的添加量没有特殊限制，只要能够目测确认溶液的显 色即可，优选为1% W下，更优选为0.1% W下。
[0088] 运些染料中，优选具有通过与核酸结合而色调发生变化的性质、W及酸碱响应性 或者氧化还原响应性运两种性质的染料，但也可W仅具有通过与核酸结合而色调发生变化 的性质或酸碱响应性或者氧化还原响应性其中之一。此外，运些染料可W使用一种，也可W 两种W上组合使用。
[0089] 因溶液中的抑而色调发生变化的染料称作"酸碱响应性染料"，诸如因氧化还原状 态而色调发生变化的染料称作"氧化还原响应性染料"。作为氧化还原响应性染料，可W列 举出例如用于酸碱指示剂、氧化还原指示剂运样的染料。
[0090] 作为具有通过与核酸结合而色调发生变化的性质的染料的例子，可W列举出甲苯 胺蓝0、甲基绿、亮甲酪蓝、龙胆紫B、维多利亚蓝B等。具体地，甲苯胺蓝0在不存在双链核酸 的情况下是深藏青色，通过与核酸结合变为淡蓝色；甲基绿在不存在核酸的情况下是淡蓝 色，通过与核酸结合变为蓝绿色。此外，亮甲酪蓝在不存在核酸的情况下是深蓝色，通过与 核酸结合变为蓝绿色。
[0091] 酸碱响应性染料是指:诸如可见于pH指示剂等的、根据溶液中的氨离子浓度(pH) 而色调改变的染料。运其中，通过从酸性到碱性，诸如酪献是从无色变为紫红色，而诸如甲 基澄是从红色变为澄色。
[0092] 此外，氧化还原响应性染料是指:在氧化状态和还原状态下色调发生变化的染料。 例如，亚甲基蓝、甲基绿的氧化型呈蓝色，而还原型则变为无色。另一方面，甲苯胺蓝0的氧 化型呈蓝色，而还原型则呈紫红色。
[0093] 在对基于核酸扩增方法的核酸的扩增进行检测时，优选在核酸扩增反应后的反应 液中添加染料，也可W在扩增反应前的反应液中预先添加染料。而且，还可W应用于未进行 扩增反应的核酸的检测。
[0094] 在使用酸碱响应性或者氧化还原响应性染料的情况下，通过增设添加下述物质的 步骤，能够增强核酸的有无引起的色调的对比度，使利用可见光的检测变得容易，所述物质 是，与双链核酸结合了的染料相比、优先和与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染 料反应的物质。即，通过使来源于与双链核酸结合了的染料的色调W外的色调发生改变、或 消失成为无色，双链核酸的有无引起的色调的对比度增强。通过上述步骤，即使在使用与双 链核酸结合、但与双链核酸的结合引起的色调变化少，或者虽然结合、但全然没有色调变化 的染料的情况下，只要染料具有酸碱响应性或者氧化还原响应性，就能够进行双链核酸扩 增的目测判定。
[00%]例如，目测辨别甲基绿与双链核酸结合时的色调的变化是困难的。但是，通过添加 优先与与单链核酸结合了的甲基绿和未与核酸结合的甲基绿反应的物质，能够消除未与双 链核酸结合的甲基绿来源的淡蓝色。通过该方法，能够容易地目测判定核酸的有无，诸如， 在着色的情况为有双链核酸存在，而在无色的情况为没有双链核酸存在。
[0096] 作为另外一个例子，甲苯胺蓝0若与双链核酸结合，则从深藏青色变化为淡蓝色。 进而，通过添加优先与与单链核酸结合了的甲苯胺蓝0、和未与核酸结合的甲苯胺蓝0反应 的物质，可W使未与双链核酸结合的甲苯胺蓝来源的深藏青色变化为紫红色，能够容易地 目测判定核酸的有无，诸如，蓝色的情况下为有双链核酸存在，紫红色的情况为没有双链核 酸存在。
[0097] 作为另外一个例子，目测辨别龙胆紫B与双链核酸结合时的色调变化是困难的。但 是，通过添加优先与与单链核酸结合了的龙胆紫B、和未与核酸结合的龙胆紫B反应的物质， 可W消除未与双链核酸结合的龙胆紫B来源的青紫色，能够容易地目测判定核酸的有无，诸 如，青紫色的情况为有双链核酸存在，无色的情况为没有双链核酸存在。
[0098] 作为另外一个例子，在中性溶液中目测辨别维多利亚蓝B与双链核酸结合时的色 调变化是困难的。但是，在中性W上的碱区域的抑环境下，未与双链核酸结合的维多利亚蓝 B来源的蓝色变化为淡红色，因而可W容易地目测判定核酸的有无，诸如，蓝色的情况为有 双链核酸存在，而淡红色的情况为没有双链核酸存在。
[0099] 在希望通过本步骤得到色调的对比度的增强效果的情况下，对使用的染料没有特 殊限制，可W是在不与双链核酸结合的情况下，显色的变化依赖于抑、氧化还原状态而从有 色到无色、或从无色到有色的染料。此外，也可W是例如从蓝色到红色运样的、色调发生变 化的染料。运其中，优选为显色的变化依赖于抑、氧化还原状态而从有色到无色、或从无色 到有色的染料，因为容易判定核酸的有无。
[0100] 在使用氧化还原响应性的染料时，作为优先与与单链核酸结合了的染料和未与核 酸结合的染料反应而使色调发生变化的物质，可W列举出氧化剂和还原剂等。
[0101] 对上述氧化剂没有特殊限制，具有氧化作用即可，包括过氧化氨、高儘酸钟、氯酸 钟、重铭酸钟、漠酸钢、漠酸钟、面素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钢、二氧化氯、氯胺、四氧化饿、二 甲基亚讽、间氯过苯甲酸等。
[0102] 同样地，对还原剂没有特殊限制，具有还原作用即可，包括棚氨化钢、氯化棚氨化 钢、亚硫酸氨钢、亚硫酸钢、次硫酸钢、焦亚硫酸钟、硫代硫酸钢、谷脫甘肤、抗坏血酸、2-琉 基乙醇、Dk二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半脫氨酸、S下基麟、氨基乙硫醇、S2-簇基乙基麟及 其衍生物等。
[0103] 此外，在使用酸碱响应性染料时，优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结 合的染料反应而使色调发生变化的物质，可W使用酸和碱。作为酸，适合使用盐酸、硫酸、硝 酸等无机酸，或者乙酸、甲酸、草酸、巧樣酸、乳酸等有机酸，对此没有限制。优选盐酸、硫酸、 乙酸、巧樣酸，特别优选盐酸、乙酸。作为碱，适合使用氨氧化钢、氨氧化钟、碳酸氨钢、碳酸 钟、氨、=乙基胺等，对此没有限制。优选氨氧化钢、氨氧化钟、碳酸氨钢，特别优选氨氧化 钢、碳酸氨钢。
[0104] 此外，作为优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调 发生变化的物质，也可W使用抑缓冲剂，通过被检物的抑变化而使色调发生变化。对于运样 的pH缓冲剂没有特殊限制，能改变被检物的P邮P可，适合使用MES、Bis-lYis、ADA、PIPES、 八〔65、]?0?50、865、]\10?5^65、皿？65、01?50^4?50、？0?50、皿？？50、6??5、时1(31116、化13、 61(：1116^4?5、(：皿5、〔4?50、〔4?5等戈氏缓冲液(6〇〇(1'8 13证'6')，甘氨酸、憐酸、邻苯二甲 酸、巧樣酸、己比妥酸、班巧酸、巧樣酸、乙酸、碳酸。
[0105] 优先与与单链核酸结合了的染料和未与核酸结合的染料反应而使色调发生变化 的物质的具体添加量因染料W及所述物质的种类而变化，因此不能一概而论，本领域技术 人员可W实验性地确定目测判定最容易的添加量。一般地，与染料反应的物质的量优选为 染料量的1000摩尔当量W下，更优选100摩尔当量W下。
[0106] 在通过该方法对核酸扩增产物进行检测的情况下，可W向核酸扩增反应后的反应 液中添加染料，再添加氧化剂、还原剂、酸、碱、pH缓冲剂等使色调发生变化的物质来增强对 比度。此外，也可W在预先添加了该染料的状态下进行扩增反应，反应后添加氧化剂、还原 剂、酸、碱等来增强对比度。此外，运些氧化剂、还原剂、酸、碱、抑缓冲剂可W仅使用1种，也 可W2种W上组合使用。而且，在运些氧化剂、还原剂、酸、碱、抑缓冲剂最初包含在含核酸的 被检物中的情况下，可W仅通过与染料反应的步骤来进行核酸检测。
[0107] 然后，在于可见光下观察通过步骤(1)中的反应生