，进而引起化嗦酷胺的耐药；位于pncA基因编码 区的突变（C.3G〉A，C.233G〉A，C.408InsA，C.538-561del和 +l-+18del)导致该基因编码的 蛋白氨基酸组成、结构或长度发生了变化，从而改变了该蛋白的功能。pncA基因突变的检测 能够用遗传领域的任意一种点突变检测方法进行，如PCR(聚合酶链反应)-RFLP法(限制性 内切酶片段多态性XPCR-测序法、DNA探针杂交法、位点特异性PCR法、PCR-地PLC(变性高 效液相色谱)、及PCR-SSCP(单链构象多态性）法等。
[0016] 上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用 探针能是与突变pncA基因核巧酸序列杂交，也可W有两个探针分别与正常或突变的pncA 基因核巧酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或巧光物质标记。此外，还 能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
[0017] 上述方法中使用的PCR引物依据已知的核巧酸序列进行设计，通常长度为18-25 个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Prime巧和01igo6设计PCR扩增引物，本发 明中设计的PCR扩增引物序列为： 上游引物：5' -TGTCGCTCACTACATCACC-3' 下游引物：5' -TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3' ； 本发明提供的检查pncA基因7个突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测pncA基因 突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用 及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测pncA基因7个突变的试剂盒，含有扩增引物、 dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或多种。本领域技 术人员已知，W上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对引物pncA-F和 pncA-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
[001引本发明的优点在于： 1、 试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者pncA基因的突变位点，从而用于耐化嗦酷 胺结核患者的诊断和治疗中； 2、 能够用于在结核患者中大规模筛查化嗦酷胺耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的感 染菌株是否具有化嗦酷胺耐药性提供服务及参考； 3、 为耐化嗦酷胺的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用运一 突变作为检测祀点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
[001引【附图说明】： 图1为结核分枝杆菌pncA基因C. 3G〉A、C. 233G〉A突变的序列图； 图2为结核分枝杆菌pncA基因C. 408InsA突变的的序列图； 图3为结核分枝杆菌pncA基因-12T〉C、-11A〉G、-7TX：突变的的序列图； 图4为结核分枝杆菌pncA基因C. 538-561del和+l-+18del突变的的序列图； 图5为pncA基因PCR产物电泳检测示意图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于 所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用 常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0021] 实施例1:采集检测样本 收集到16株耐化嗦酷胺结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏化嗦酷胺（PZA量1μg/ml)试验检测结果可知，共获取16株耐化嗦酷胺结核菌株。耐化嗦酷胺患者平均年 龄为40岁。男性患者占比68. 75%% (11/16)，年龄介于15~69岁，平均年龄为40. 3岁； 女性患者占比31. 25% (5/16)，年龄介于21~49岁，平均年龄39. 4岁。
[002引实施例2:基因组DNA的提取 1、 采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5mlEP管中（尽量不要刮取到培 养基）； 2、 向菌体沉淀物的离屯、管中加入500μ1细胞悬浮液(先检查是否已加入Lysozyme)， 使用移液器或縱满振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37°C溫浴30min每隔5-10min颠倒 混匀数次。12 000巧m(~13 400Xg)离屯、2min,尽量吸净上清； 3、 向菌体沉淀中加入225μ1缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮； 4、 向管中加入10μ1蛋白酶Κ溶液，颠倒混匀； 5、 加入25μ1裂解缓冲液S，颠倒混匀；57°C水浴放置20min,其间颠倒混匀数次。
[0023] 6、加入250μ1缓冲液B，振荡5S充分混匀； 7、 加250μ1无水乙醇，充分振荡混匀15S，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离屯、W去 除管内壁的水珠； 8、 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000 巧m(~13 400Xg)离屯、30S，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中； 9、 向吸附柱中加入500μ1缓冲液C，12 000巧m(~13 400Xg)离屯、30S，倒掉废液， 将吸附柱放入收集管中； 10、 向吸附柱中加入700μ1漂洗液W2(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000 巧m(~13 400Xg)离屯、30S，倒掉废液，吸附柱放入收集管中； 11、 向吸附柱中加入500μ1漂洗液W2,12 000巧m(~13 400Xg)离屯、30S，倒掉废 液，将吸附柱放回收集管中，然后12 000巧m(~13 400Xg)离屯、2min,将吸附柱置于一 个新的1. 5ml离屯、管中，室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残余的漂洗液； 12、 将吸附柱转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135μ1洗脱缓 冲液ΤΕ，室溫放置2-5min, 12 000巧m(~13 400Xg)离屯、2min,将溶液收集到离屯、管 中，冻于-40°C，待实验研究使用。
[0024] 实施例3:PCR扩增，电泳结果 W提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为pncA基因，所 用引物 5, -TGTCGCTCACTACATCACC-3,和 5, -TCGTAGGTCATAGCGTAGG-3，。
[002引PCR扩增体系：2XPCR预混液25μL(含rTaq酶，TAKARA)，正反向引物各1μΜ， 模板DNA50ng，加入21μL去离子水。
[0026] PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火 30秒，72度延伸1分30秒)，最后终末72度延伸5分钟。扩增产物长度为867bp，然后进 行琼脂糖凝胶电泳检测，选用化2000型号DNAmarker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度 为1. 5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入 邸染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录。电泳结果见图5。
[0027]实施例4:测序结果 PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5' -TGTCGCTCACTACATCACC-3'，测序 后经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点-12T〉C、-11A〉G、-7T〉C、C. 3G〉A、 c. 233G〉A、c. 408InsA、c. 538-561del和 +l-+18del，突变图谱见图 1、2、3、4。
【主权项】
1. 一种用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结 核分枝杆菌pncA基因-12T>C、-llA>G、-7T>C、c. 3G>A、c. 233G>A、c. 408InsA、c. 538-561del 和+l-+18del突变的试剂。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQID NO:1和SEQIDNO:2所示的引物。
【专利摘要】本发明公开了用于检测结核分枝杆菌pncA基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌pncA基因-12T>C、-11A>G、-7T>C、c.3G>A、c.233G>A、c.408InsA、c.538-561del和+1-+18del突变的试剂；该试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者pncA基因的突变位点，从而用于耐吡嗪酰胺结核患者的诊断和治疗中。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/32, C12Q1/68
【公开号】CN105331709
【申请号】CN201510802642
【发明人】张阿梅, 夏雪山, 李道群, 宋玉竹
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月19日