同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时荧光pcr引物探针组合及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学检测技术，具体地说，设及一种同时检测引起苹果牛眼果 腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合及方法。
【背景技术】
[0002] 苹果牛眼果腐病度uirs-eyerotofapple)是我国关注的进境水果真菌病害， 病原菌包括Neofabraeamalicorticis、N.perennans、N.a化a和N.kienholzii运 4 个种， 其中N.malicodicis(异名：Peziculamalicodicis)被列入我国进境植物检疫性有害生 物名录中。苹果牛眼果腐病是苹果和梨重要的采后病害，难W防控，不仅为害果实，导致严 重的采后损失，而且可侵害枝条、树干，导致树势衰弱、幼树死亡。其在世界范围内广泛分 布，但尚未在我国发现。该病一旦传入我国，在我国苹果产区扩散、定殖的可能性很大，将对 我国苹果生产造成严重威胁，十分必要加大口岸检疫力度，严防该病菌的传入。然而，苹果 牛眼果腐病菌相似的形态特征和生理特性使运些病原菌的区分非常困难，要求鉴定者必须 具备丰富的真菌分类学基础与经验。加之传统检验方法周期长，不符合进境水果快速通关 的要求，使其成为进境水果真菌病害检疫的瓶颈。因此建立快速准确的检测体系尤为必要。
[0003] 近年随着分子生物学技术的迅速发展，大量WPCR为基础的技术广泛地运用到植 物病原菌的鉴定中，大大提高了鉴定的速度和准确性。实时巧光PCR结合了巧光检测系统 和PCR扩增系统，通过巧光放大检测信号，在PCR扩增的过程中就能检测模板DNA的扩增， 不需要凝胶电泳分析，简化了检测程序，与常规的PCR比较更能缩短检测周期。而且其检测 特异性强，灵敏度高，其运用范围越来越广泛。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对W上要解决的技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高的同 时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种用于实时巧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4 种病原菌的试剂盒。
[0006] 本发明的再一个目的是提供同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时 巧光PCR方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供了一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病 原菌的实时巧光PCR引物探针组合，该引物探针组合包括W下引物：
[0008] NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3';
[0009] NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3f;
[0010] MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；
[0011] 阳R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B册2 ;
[0012] ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B册 1 ;
[0013] KIE-P :肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ;
[0014] 其中，FAM、CY5、肥D、肥X为巧光基团，MGB、B册1、B册2为巧灭基团。
[0015] 上述引物中，Neo F和化0R为检测苹果牛眼果腐病的4种病原菌的通用引物； MAkPa为检测N. malico;rticis的特异性探针；PER-Pb为检测N. perennans的特异性探针； ALB-Pc为检测N. a化a的特异性探针；KIE-Pd为检测N. kienholzii的特异性探针。
[0016] 本发明还提供了用于实时巧光PCR检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的试剂 盒，该试剂盒含有上述引物探针组合。
[0017] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液中的至少 一种。
[0018] 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0019] 本发明进一步提供了一种同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧 光PCR方法，即利用所述引物探针组合进行实时巧光PCR检测待测样品。
[0020] 具体地，所述方法包括W下步骤：1)提取待检测样品中的DNA;2)W步骤1)中提 取的DNA为模板，进行实时巧光PCR扩增反应；3)分析Ct值。
[002。 其中，实时巧光PCR反应体系W20μL计为：
[002引模板DNA 50ng，
[0023] 引物 每条引物的终浓度均为〇.5μπιο1/1，
[0024] 探针 每条探针的终浓度均为0. 25 μ mol/l，
[00巧]2XThunderbird Probe qPCR Mix 10 μL,
[0026] (1地2〇补足至20 μ L ;
[0027]其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix内含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲 液、ROX。2X化underbirdProbeqPCRMix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，货号 为WS-101。
[0028] 其中，实时巧光PCR反应条件为：95°C10分钟；94°C15秒，60°C60秒，共40个循 环，每个循环结束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下检测巧光信号。
[0029] 上述方法中，步骤3)中根据FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信号Ct值进行结果 判断。若FAM通道下Ct值小于35,贝Ij判为N.malicodicis阳性，若Ct值大于35或无扩增 信号则判为N.malico;rticis阴性；若CY5通道下Ct值小于35,卯J判为N.perennans阳性， 若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.perennans阴性；若肥D通道下Ct值小于35,卯J判 为N.a化a阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.a化a阴性；若肥X通道下Ct值小 于35,卯J判为N.kienholzii阳性，若Ct值大于35或无扩增信号则判为N.kienholzii阴 性；
[0030] 本发明根据4种苹果牛眼果腐病菌的EF-la基因特异序列，设计了 1对通用引物 和4条特异性探针，并基于运些引物探针组合建立了同时检测引起苹果牛眼果腐病的4种 病原菌的实时巧光PCR方法，可实现对样品的定性检测。
[0031] 实验表明，本发明的引物探针组合、试剂盒及检测方法特异性好、灵敏度高、通量 高、快速，提高了检测效率，为引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的检测提供了更有效的方 法。
【附图说明】
[0032]图1为本发明在FAM通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-2分别为菌株CBS 102863、CBS102872。
[0033]图2为本发明在CY5通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-6分别为菌株CBS 139. 4UCBS102869、CBS102873、CBS453. 64、VPRI41734、VPRI10502。
[0034]图3为本发明在肥D通道下的特异性实验结果，其中从左至右1-6分别为菌株CBS 109875、CBS102871、CBS628. 72、CBS452. 64、CBS304. 62、CBS261.32。
[0035] 图4为本发明在肥X通道下的特异性实验结果，其中1为菌株CBS355. 72。
[0036] 图5为本发明在FAM通道下的灵敏度实验结果，其中1-6分别为浓度10化g/μ^ lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0037] 图6为本发明在CY5通道下的灵敏度实验结果，其中1-5分别为浓度l(K)ng/μL lOng/μL Ing/μLO. Ing/μL和 0.Olng/μL。
[0038] 图7为本发明在肥D通道下的灵敏度实验结果，其中1-6分别为浓度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0039] 图8为本发明在肥X通道下的灵敏度实验结果，其中1-6分别为浓度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
【具体实施方式】
[0040] W下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0041] 实施例1检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合
[0042] 根据引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的EF-1α基因特异序列，设计了如下检测 引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR引物探针组合，引物序列如下：
[0043]NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3'(沈QIDNo. 1);
[0044]NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3< (沈QIDNo. 2);;
[0045]MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB(SEQIDNo. 3)；
[0046]阳R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B册2(沈QIDNo. 4);
[0047]ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B册 1 (沈QIDNo. 5);
[0048]KIE-P:肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB(SEQIDNo. 6);
[0049] 其中，FAM、CY5、肥D、肥X为巧光基团，MGB、B册1、B册2为巧灭基团。
[0050]NeoF和化οR为检测苹果牛眼果腐病的4种病原菌的通用引物；MAkP为检测 N.malico;rticis的特异性探针；PER-P为检测N.perennans的特异性探针；ALB-P为检测 N.a化a的特异性探针；KIE-P为检测N.kienholzii的特异性探针。
[0051] 实施例2检测引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的实时巧光PCR特异性实验
[00閲 1、DNA的提取
[0053]提取表1中21株菌株的基因组DNA。将供试菌株在PDA平板上20°C黑暗培养7~ lOd，收集菌丝，液氮研磨，取0.Ig参照试剂盒说明操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号 为DP305-02,天根生物科技有限公司）分别提取引起苹果牛眼果腐病的4种病原菌的基因 组DM。
[0054]菌株1-13、16-19购买于荷兰菌种保藏中屯、（CB巧；菌株14-15由澳大利亚环境与 初级产业部（Dep曰rtmentofEnvironment曰ndPrim曰ryIndustries,Austr曰li曰）提供； 菌株20保藏于广东出入境检验检疫局检验检疫技术中屯、，