一种tRNASer(UCN)基因检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程技术领域，具体设及一种非综合征性耳聋相关的线粒体 tRNASerWCN)基因A7445C突变检测方法及试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] 耳聋是影响人们正常生活的常见疾病，新生儿中患有先天性耳聋的比例约为千分 之一，而有60%W上的先天性耳聋患者是由遗传因素引起的。根据除耳聋W外是否有其他 并发症，可W将遗传性耳聋分为综合征性耳聋和非综合征性耳聋，前者在遗传性耳聋中约 占30%，后者所占比例约为70%。
[0003] 线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化憐酸化和合成Ξ憐酸腺巧 (AT巧的主要场所，为细胞的活动提供能量，所W有"细胞动力工厂"之称。除了为细胞供能 夕F，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞调亡等过程，并拥有调控细胞生长和细 胞周期的能力。
[0004] 线粒体DNA，尤其是12SrRNA和tRNASerWCN)基因是与耳聋相关的基因突变热点 区域。2006年GuanMX等人发现，tRNASerWCN)A7445C突变可能与非综合征性耳聋相关。
[0005] 目前对于突变检测最常用方法为第一代测序技术，但此技术对仪器要求高，操作 繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段长度 多态性（PCR-RFL巧是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程中影 响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱值HHX)和基因忍片的应用为点突 变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但 设及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的 突变筛查方法应用与临床突变筛查。
[0006] 中国专利CN201310172063. 0公开了一种检测耳聋相关的线粒体DNAT7505C突变 的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T7505C片段的PCR混合液、针对T7505C设计的一对外 引物、针对T7505C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照和盒体组成。但 是该方法在操作过程中存在杂合突变、胶压缩、GC富集区的等问题，很难通过一次测序获得 精确的数据。
[0007] 中国专利CN200910050224. 2公开了一种线粒体基因耳聋相关新突变12201T>C 所在序列具有序列1的结构；采用线粒体基因耳聋相关新突变对耳聋患者进行线粒体突变 位点优先检测，有助于排除或诊断线粒体基因突变导致的耳聋；可采用线粒体基因耳聋相 关新突变制备诊断探针、引入突变造成酶切位点的引物和试剂盒，能简便快捷的进行线粒 体相关耳聋的筛查。但是该利用该结构进行检测时，操作复杂、耗时较长，且仪器设备昂贵。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于：提供了一种操作简便、易掌握的tRNASeHUCN) 基因检测方法及应用，对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验 室开展，为全国性开展非综合征性耳聋相关的线粒体tRNASerWCN) 7445A乂突变的大规模 筛查和预防性检查提供条件。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种线粒体tRNASerWCN)基因A7445C突变 检测试剂盒，所述试剂盒包括：提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂和酶切反 应试剂。
[0010]所述提取样本全基因组DNA的试剂可W进一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-异戊醇混合液和溶液II;所述溶液I为蛋白酶K溶液，溶液II为氨氧化钢溶液； W11] 所述PCR扩增反应试剂还可W进一步包括：dNTP、10XPCR缓冲液、MgC12、引物、 Taq酶和Ξ蒸水；
[0012] 所述酶切反应试剂还可W进一步包括：限制性内切酶甜alMIX体系和Ξ蒸水。
[0013] 所述引物序列优选为：
[0014]SerWCN)F5，-ACGCCAAAATCCATTTCACT-3 '
[0015]SeHUCN)R5，-CGGGAATTGCATCTGTTTTT-3，。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种线粒体tRNASeHUCN)基因A7445C突 变检测中使用的引物，所述引物特异性的扩增包含7445位点的序列，并且扩增的序列中不 含有其它TCTAGA回文结构。
[0017] 为解决上述技术问题，本发明又提供了一种线粒体tRNASeHUCN)基因A7445C突 变检测中使用的引物，所述引物中无连续出现的5个同一碱基，GC含量为40%，无引物二聚 体和发夹结构，设计引物人工合成。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明再提供了一种线粒体tRNASeHUCN)基因A7445C突 变的检测方法，所述方法包括：
[0019]步骤SO 1，提取全基因组DNA;
[0020]步骤S02，特异性PCR扩增及酶切；
[0021] 步骤S03,突变鉴定。
[0022] 所述步骤S02,特异性PCR扩增及酶切，可W进一步包括：采用专一性限制性内切 酶甜al在一对Ser(UCN)F和Ser(UCN)R引物的配合下，对样本的全基因组DNA进行PCR扩 增和酶切；
[0023] 所述Ser〇JCN)F和Ser〇JCN)R引物的扩增优选包含7445位点的序列，且扩增的序 列中不含有其它TCTAGA回文结构；
[0024] 所述检测方法优选利用特异性PCR扩增技术和专一性限制性内切酶Xbal特异性 的识别TCTAGA回文结构的特性，每份DNA样本通过一次特异性的PCR反应和一次酶切反应 进行检测。
[00巧]为解决上述技术问题，本发明又提供了一种前述任一项线粒体tRNASeHUCN)基 因A7445C突变检测中使用的引物在制备检测试剂盒中的应用。
[00%] 所述步骤SOI，提取全基因组DNA，可W进一步包括：运用蛋白酶K消化裂解蛋白 质，然后采用酪-氯仿-异戊醇法从细胞/血液/组织样本中提取全基因组DNA。
[0027] 述步骤S03,突变鉴定，可W进一步包括：将酶切后的产物进行聚丙締酷胺凝胶电 泳，根据酶切后产生的DNA片段大小不同，检测线粒体tRNASerWCN)基因7445位点突变状 况。
[0028] 本发明有益的技术效果在于：
[0029] 1.本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续实验研究，如血液样 本可建立永生化类淋己母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组织可用于诱导多功 能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源。
[0030] 2.本发明试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶甜al特异性的 识别TCTAGA回文结构的特点，每份DNA样本用1对特异性引物进行PCR扩增，然后用专 一性限制性内切酶Xbal进行1次酶切即可在几小时内对非综合征性耳聋相关的线粒体 tRNASeHUCN)基因A7445C突变进行检测。
[0031] 3.与其他检测方法相比，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作 人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，为全国性开展非综合征性耳聋相 关的线粒体tRNASeHUCN)7445A乂突变的大规模筛查和预防性检查提供条件。
【附图说明】
[0032]图1为本发明实施方式所述的特异性条带扩增循环条件图；
[0033] 图2为本发明实施方式所述突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物图；
[0034] 图3为本发明实施方式所述突变样本、对照样本测序峰图；
[0035] 图4为本发明检测方法流程示意图。
【具体实施方式】
[0036]W下将结合实施方式来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术 手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据W实施。
[0037] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方式及实施方式中的特征可 W相互组合。
[0038] 本发明通过酶切法进行非综合征性耳聋相关的线粒体tRNASerWCN) 7445A乂突 变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，提供非综合征性耳聋相关的线粒 体tRNASerWCN) 7445A乂突变检测试剂盒，W及该方法或该的试剂盒在检测与非综合征性 耳聋相关的线粒体tRNASerWCN) 7445A乂突变检测中的应用。
[0039] 本发明的一实施方式中，提供了一种线粒体tRNASeHUCN)基因A7445C突变检测 试剂盒，所述试剂盒包括：提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂和酶切反应试 剂。
[0040]所述提取样本全基因组DNA的试剂可W进一步包括：裂解液、溶液I、酪-氯 仿-异戊