葡萄串样纳米粒子、免疫探针、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种葡萄串样纳米颗粒(GCNPs)-酶-免疫探针的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]酶联免疫分析技术是一种非常成熟的固相免疫分析模式，在临床诊断分析中已经获得了多年的应用，同时，近十年来，也在环境监测、食品安全危害物检测等领域中获得了广泛的应用。临床诊断和食品安全检测领域所面临的重要问题是低浓度抗原的免疫检测，以及其检测的准确性和可靠性。提高免疫检测灵敏度的方法之一就是制备高灵敏的免疫探针。
[0003]贵金属纳米材料是一种重要的纳米材料，不仅具有纳米材料的宏观特征，同时其自身的物理化学性质也与纳米材料的性能有机结合了起来，具有粒径均一，分散性好，比表面积大等特性，因此可用于纳米免疫探针的制备。
[0004]目前，在环境监测、食品危害物分析等许多领域，都对更高灵敏度的免疫分析方法具有迫切的需求，因此，提高传统的酶联免疫分析方法的检测性能，具有重要的应用价值。许多研究采用新的检测模式，如化学发光、电化学发光，与传统酶联免疫分析方法相比，它们具有更灵敏的检测能力，但是这些免疫分析方法需要较昂贵的设备和试剂，因此，检测成本显著提高，这极大地阻碍了其在环境监测、食品危害物分析等许多领域的应用。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种葡萄串样纳米粒子(GCNPs)及其制备方法。
[0006]本发明的目的之二在于提供所述葡萄串样纳米粒子的用途，例如，其在制备免疫探针中的用途。
[0007]本发明的目的之三在于提供一种基于所述葡萄串样纳米粒子的免疫探针(葡萄串样纳米-酶-免疫探针，或称GCNPs-酶-免疫探针，或者信号放大GCNPs-酶-免疫探针，简称免疫探针)及其制备方法。
[0008]本发明的目的之四在于提供所述免疫探针在酶联免疫检测中的应用，例如，基于所述免疫探针的酶联免疫检测方法。
[0009]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括:
[0010]—种葡萄串样纳米粒子(GCNPs)的制备方法，其包括:以蛋白修饰的纳米银三角片作为模板，并以氯金酸作为氧化剂，通过伽凡尼取代反应制备葡萄串样纳米粒子。
[0011 ] 所述GCNPs具有比表面积大、分散性良好等特性。
[0012]其中，所述纳米银三角可以采用常规方法制备，例如可参考Zhang，Q.;Li，N.;Goebl, J.；Lu, Z.；Yin, Y.J.Am.Chem.Soc.2011，133，18931-18939 等文献制备。
[0013]在一较佳实施方案之中，所述的葡萄串样纳米粒子的制备方法包括:
[0014](I)将牛血清蛋白加入尺寸为15nm?30nm的纳米银三角的溶液中混合均勾，使形成的混合溶液中牛血清蛋白的浓度为0.01mg/mL?5mg/mL，且牛血清蛋白与纳米银三角的摩尔比为5:1?20:1，并静置过夜；
[0015](2)向步骤⑴所获混合反应溶液中加入抗坏血酸，使形成的混合物中抗坏血酸的浓度为0.08mM?5mM之后以0.1mT,/miη?2mT,/miη的速度注入浓度为0.0lmM?0.5mM的HAuCl4溶液，获得葡萄串样纳米粒子。
[0016]由前述方法制备的葡萄串样纳米粒子，其粒径为20nm?50nm。
[0017]一种免疫探针，其包含所述的葡萄串样纳米粒子，所述葡萄串样纳米粒子上修饰有辣根过氧化物酶标记的抗体(IgG-HRP)。
[0018]其中，IgG-HRP是吸附在GCNPs表面。
[0019]—种免疫探针的制备方法，其包括:将所述的葡萄串样纳米粒子分散于含有0.1mM?1mM碳酸钾或碳酸钠的0.01?0.2mg/mL辣根过氧化物酶标记的抗体溶液中，0°C?8°C震荡Ih?5h，之后于8000rpm?1000rpm离心1min?20min，进而于沉淀中获得所述免疫探针。
[0020]进一步的，所述的免疫探针的制备方法还可包括:将离心获得的沉淀以含有0.01mg/mL?0.lmg/mL辣根过氧化物酶的溶液重悬，备用。
[0021]所述IgG-HRP是针对不同检测物的一个结构域、或者有效基团的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，或多克隆抗体。
[0022]在一典型实施案例中，所述免疫探针的制备方法可以包括:将0.5-2mLGCNPs复合材料8000rpm离心lOmin，用含有0.0OlM碳酸钾的0.01-0.2mg/mLIgG-HRP (辣根过氧化物酶标记的抗体)溶液重悬，4°C震荡3h，9000rpm离心15min，用0.5_lmL含有0.01-0.1mg/mL辣根过氧化物酶的酶标稀释液重悬。
[0023]在一更为具体的实施案例之中，所述免疫探针的制备方法包括以下具体步骤:
[0024]1.利用基于蛋白修饰的纳米银三角片为模板，氯金酸为氧化剂，通过伽凡尼取代反应制备GCNPs:
[0025]a.将200 μ L牛血清蛋白溶液(10mg/mL)加入到40mL纳米银三角(0.1 μ Μ)溶液中，混合均匀，静置过夜。
[0026]b.取5-10mL上述混合溶液，加入825 μ L，0.01-0.6Μ抗坏血酸(AA)，再将5_20mL，0.08mM的HAuCl4W lmL/min的速度注射入，得到GCNPs ；
[0027]I1.GCNPs-酶-免疫探针的制备
[0028]a.将0.5-2mL步骤Ib所获的GCNPs8000rpm离心lOmin，用含有0.0OlM碳酸钾的 0.01-0.2mg/mLIgG-HRP 溶液重悬，4 °C 震荡 3h，9000rpm 离心 15min，用 0.5-lmL 含有0.01-0.lmg/mL辣根过氧化物酶的酶标稀释液重悬，即得到信号放大GCNPs-酶-免疫探针。
[0029]本发明中由于GCNPs具有极高的比表面积，单个纳米材料可以同时负载多个酶标记抗体分子，进而极大提高免疫探针中酶与抗体的比例，因此，使用该免疫探针进行免疫分析，特别是对微量的待分析物进行免疫检测时，可放大免疫检测的信号，提高检测灵敏度。
[0030]所述的免疫探针在酶联免疫检测中的应用。
[0031 ] 一种酶联免疫检测方法，其包括:
[0032]将所述的免疫探针与一系列不同浓度的目标抗原标准样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并记录检测型号，由此建立免疫探针检测信号与抗原浓度之间的标准对应关系；
[0033]以及，将所述免疫探针与含有未知浓度的目标抗原的待测样品在适于使免疫探针中所含抗体与所述抗原特异性结合的液相环境中进行酶联免疫反应，并依据检测型号及所述标准对应关系而确定待测样品中的目标抗原浓度。
[0034]—种基于所述免疫探针的间接竞争酶联免疫分析方法，包括以下步骤:
[0035]a.将作为包被抗原的小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物溶于碳酸盐缓冲液而形成包被液，25°C?37°C孵育I?4h，再以磷酸盐缓冲液洗涤后，加入以作为封闭液的、浓度为0.001wt%的分子量为2000?10000的聚乙二醇溶液于0°C?8°C封闭过夜；
[0036]b.将步骤a所获的包被抗原溶液与一系列不同浓度的小分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液混合，再加入含小分子抗体的酶标稀释液，25°C?37°C孵育后，以磷酸盐缓冲液洗涤，所述酶标稀释液采用包含0.1wt %明胶和0.05v/v%吐温-20的pH值为7.0?8.0、浓度为0.0lM?0.05M的磷酸盐缓冲液；
[0037]c.向步骤b所获的各竞争反应混合体系中加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt %明胶和0.05v/v%吐温-20的pH值为7.0?8.0、浓度为0.0lM?0.05M的磷酸盐缓冲液，25°C?37°C孵育0.5h?2h后，以磷酸盐缓冲液洗涤；
[0038]d.向步骤c所获的各混合反应体系中分别加入显色液，25°C?37°C显色1min?30min，再加入作为终止液的、浓度为2M?4M的硫酸溶液，之后测量各混合反应体系于波长为450nm?650nm时的吸光值A，建立A与抗原量的标准对应关系。
[0039]在一更为具体的实施方案之中，所述间接竞争酶联免疫分析方法包括以下步骤:
[0040]a.以小分子半抗原与卵清蛋白或牛血清蛋白的偶联物作为包被抗原，并以浓度为0.01-0.1M、pH值为9-10的碳酸盐缓冲液按1:2000?1:16000的体积比进行稀释后作为包被液加入酶标板的不同孔中，25-37°C孵育l_4h，PBST洗涤液洗涤3_5次，然后加入作为封闭液的、浓度为0.0Olwt-%的分子量为2000-10000的聚乙二醇溶液，0_8°C封闭过夜；
[0041]b.在前述酶标板的不同孔中再分别加入含有一系列不同浓度的小分子标准品的磷酸盐缓冲液溶液，再加入含小分子抗体的酶标稀释液，25-37°C孵育0.5-2h后以PBST洗涤液洗涤3?5次，所述酶标稀释液采用包含0.1wt%明胶和0.05% (v/v)吐温-20的pH值为7.0-8.0、浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液；
[0042]c.在前述酶标板的不同孔中再分别加入含有所述免疫探针的抗体稀释液，所述抗体稀释液采用包含0.1wt-%明胶和0.05% (v/v)吐温-20的pH值为7.0-8.0、浓度为0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液，25-37。。孵育0.5_2h后，以PBST洗涤液洗涤3?5次;
[0043]d.在前述酶标板的不同孔中再分别加入显色液，25_37°C显色10_30min，最后每孔加入作为终止液的、浓