实施例中，底衬7上顺次搭接样品垫1、标记垫2、包被膜3以及吸水纸4，样品垫1是加样区，用于吸取待测便隐血检测样本，包被膜3上设有检测线和质控线。
[0028]标记垫2上使用的是胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl(15yg/mL)和鼠抗人Tf单克隆抗体Tn(18yg/mL);包被膜3的检测线一和检测线二分别包被另一株鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2(1.8mg/mL)和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2(1.5mg/mL)。包被膜3的质控线包被浓度为0.8mg/mL的羊抗鼠IgG(其中鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl和Hb2采购自广州格瑞林生物科技有限公司，鼠抗人Tf单克隆抗体Tfl和Tf 2采购自山东奥创生物技术有限公司，羊抗鼠IgG来自长沙博优生物科技有限公司)，用于检测试纸条的有效性，鼠抗人Hb单克隆抗体Hb2、鼠抗人Tf单克隆抗体Tf2和羊抗鼠IgG的用量按膜包被液量均为Ιμ?/cm。
[0029]检测便隐血的胶体金双联卡试纸条的制备包括以下步骤:
[0030]1.胶体金溶液的制备
[0031]加热一份595g纯化水，加入2.4ml10 %氯金酸，煮沸。在搅拌的条件下再加入3.6ml 10%柠檬酸三钠，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后继续煮沸，lOmin后停止加热，继续搅拌至冷却，得到胶体金溶液。使用紫外扫描确定最大吸收峰波长为530nm。
[0032]2.胶体金标记蛋白的制备
[0033]取两个试管加入胶体金溶液分别标记鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl和鼠抗人Tf单克隆抗体Tfl。试管1加入12yl/mL的0.1M碳酸钾水溶液，再加入15yg/mL鼠抗人Hb单克隆抗体Hbl;试管2加入ΙΟμΙ/mL的0.1M碳酸钾水溶液，再加入18yg/mL鼠抗人Hb单克隆抗体Tfl;两试管待充分混匀后，分别加入1 %BSA，封闭10分钟后，以12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用50mM、pH8.0磷酸盐缓冲液溶解至原体积的10%。用含1 %BSA、2 %蔗糖的20mM、pH8.0磷酸盐缓冲液将两种胶体金复溶液分别稀释4倍后混合，将稀释后的基础液按50yL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37°C真空干燥1小时，裁剪宽度为7_，得到标记垫。
[0034]3.包被膜的制备
[0035]分别将另一种鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2和鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2用包被缓冲液调节至浓度为1.8mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为1.5mg/mL,将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2和鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2喷到包被膜上检测线T1和T2线，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控区C线，所述鼠抗人血红蛋白单克隆抗体Hb2、鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体Tf2和羊抗鼠多克隆抗体的用量按包膜包被液量均为?μ?/cm。质控线和两条检测线间隔4_，在湿度〈30%，温度37°C烘箱中晾干10小时，封袋，备用；
[0036]4.在底衬(尺寸为60*300mm)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(尺寸为18*300mm，玻璃纤维棉材质，先经50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液浸渍处理2h)、标记垫(尺寸为7*300mm，玻璃纤维棉材质)、包被膜(尺寸为25*300mm，硝酸纤维素材质)和吸水纸(尺寸为16*300mm)得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
[0037]本发明检测便隐血的胶体金双联卡试纸条，在使用时，组装在由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳中(参见图3)，塑料上壳设有两个开孔，加样窗和显示孔，加样窗对应于所述的检测便隐血胶体金双联卡试纸条样品垫1，结果显示窗对应于所述检测便隐血胶体金双联卡试纸条的检测线5和质控线6，该检测便隐血胶体金双联卡试纸条可以从该塑料外壳中取出。
[0038]采用质控品(血红蛋白配制浓度200ng/ml，400ng/ml，lyg/ml，20yg/ml;转铁蛋白配制浓度40ng/ml，100ng/ml，400ng/ml，40yg/ml)对本发明产品和市购产品进行检出限检测，结果见图2，结果显示:本发明产品Hb检出限为200ng/ml，万华产品lyg/ml仍检不出来，20yg/ml检出；本发明产品Tf和万华Tf检出限均为40ng/ml，可见本发明产品灵敏度较高，而且本发明产品仅需一次加样即可，操作更为方便。
【主权项】
1.一种检测便隐血的胶体金双联试纸条，由底衬以及粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，其特征在于:所述样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上； 所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体，鼠抗人Hb单克隆抗体浓度为5?20yg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体浓度为5?20yg/mL; 所述包被膜上依次设置有检测线一、检测线二和质控线，检测线一和检测线二包被有与标记垫中的抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体，质控线包被有鼠抗IgG;检测线一包被的鼠抗人Hb单克隆抗体的浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm;所述检测线二包被的鼠抗人Tf单克隆抗体的浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm;所述质控线包被的羊抗鼠IgG浓度为0.5?2mg/mL，用量按膜包被液量为30μ1/27?35cm。2.如权利要求1所述的胶体金双联试纸条，其特征在于:所述胶体金颗粒的紫外扫描最大吸收波长为500?550nmo3.如权利要求1所述的胶体金双联试纸条，其特征在于:检测线一、检测线二和质控线间隔距离为3?5mm。4.一种制备如权利要求1所述胶体金双联试纸条的方法，所述方法包括: (1)制备0.01 %?0.04 %的胶体金颗粒溶液，将鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体分别进行标记，待充分混勾后，加入1 %BSA，封闭5?15分钟后，以12000rpm离心5?15分钟，弃上清，沉淀用20?100mM、pH7.5?8.5磷酸盐缓冲液溶解至原胶体金颗粒溶液体积的10%，放置于2?8°(3条件下备用；用含1%854、2%蔗糖的20?10011^、？!17.5?8.5磷酸盐缓冲液将两种胶体金溶液按2?10倍进行稀释后混合，将稀释后的溶液按40?60yL/cm2玻璃纤维均匀涂垫，37°C真空干燥0.5?1.5小时，裁剪宽度为5?10mm，得到标记垫； (2)分别将与步骤(1)中抗体具有不同表位的鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体用包被缓冲液调节至浓度为0.5?2mg/mL，将羊抗鼠IgG用包被缓冲液调节至浓度为0.5?2mg/mL，将鼠抗人Hb单克隆抗体和鼠抗人Tf单克隆抗体分别喷到包被膜上检测线一和检测线二处，将羊抗鼠IgG喷到包被膜上的质控线处;所述鼠抗人Hb单克隆抗体、鼠抗人Tf单克隆抗体和羊抗鼠IgG的用量按包膜包被液量均为30μ1/27?35cm;质控线以及两条检测线间隔3?5mm，在湿度〈30%，温度30?40°C烘箱中晾干8?12小时，封袋，备用； (3)在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，切割得到所述试纸条。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于:所述样品垫为经过20?100mM、pH7.5?8.5的Tris-HCl缓冲液处理过的玻璃纤维棉材质，标记垫为玻璃纤维棉材质，包被膜为硝酸纤维素材质，底衬为PVP胶板材质。
【专利摘要】本发明涉及一种检测便隐血的胶体金双联试纸条及其制备方法，由底衬以及顺次搭接粘贴在底衬上的样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸组成，所述标记垫上包含有胶体金标记的鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1和鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1，鼠抗人Hb单克隆抗体Hb1浓度为5～20μg/mL，鼠抗人Tf单克隆抗体Tf1浓度为5～20μg/mL。本发明对粪便中血红蛋白和转铁蛋白进行同步检测，特异性强，灵敏度高(Hb检出限为200ng/ml，Tf检出限均为40ng/ml)，对消化道出血性疾病的阳性检出率有显著提高，能准确检测无症状、少量、持续，肉眼和显微镜下看不到的消化道出血，并且不受动物血等药物干扰。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/558
【公开号】CN105467124
【申请号】CN201510957596
【发明人】张云, 张肖, 胡亮, 王选东, 杨福太, 李文斌
【申请人】厦门稀土材料研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月18日