肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，肾素化学发光免疫检测试剂盒包括：肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。这种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成肾素的检测这种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到1pg/mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
【专利说明】
肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及体外检测领域，尤其设及一种肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 肾素主要由肾小球旁细胞分泌，释放入肺循环中的血管紧张素转换酶的作用转化 为血管紧张素 n。血管紧张素 n可直接使小动脉平滑肌收缩，外周阻力增加，从而使肾小管 远端集合管钢再增强，导致体内水与钢滞留。血管紧张素 n和转换酶等经常存在于血浆中， 因此肾素的释放是决定血浆中血管紧张素浓度的关键性条件。
[0003] 高血压是最常见的屯、血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的屯、、脑、肾并 发症，是脑卒中和冠屯、病的主要危险因素。血浆肾素含量的检测，可用于诊断高血压，诊断 原发性醒固酬增多症，W及为原发性高血压病人屯、血管系统的并发症的发生提供有效的信 息等。另外还可用于高血压患者的预后评估。
[0004] 目前临床检测肾素的常见方法有酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化学发 光法，但运些方法都存在着一些不足之处。
[0005] -、酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法巧LISA)被广泛应用，但该方法也存在着下述的不足之处： (1) 使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反 应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单 人份的检测； (2) 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使 用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注 试剂的操作也极为繁琐； (3) 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知 悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大 的随意性； (4) 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影 响检测结果的准确性； (5) 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复 杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差； (6) 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数X 48/96人份，如果需要检 测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10X48/96人份，如果只有一份样本需要检测10 个不同的项目，也需要配置10 X 48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
[0006] 二、放射免疫分析法 放射免疫分析方法放射性污染大、加样步骤繁琐、操作复杂、操作时间长、测定结果不 稳定、试剂保存时间短、试剂盒操作自动化程度低、配套仪器价格昂贵等不足之处。
[0007] 二、化学发光法 化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
[0008] 酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶(皿P)和碱性憐酸酶两种，但都有一定的局 限性，辣根过氧化物酶主要缺点为:鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H202 氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定， 要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性憐酸酶主要缺点为:底物达到平台期的时 间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。
[0009] 叮晚醋作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势，主要表现 在:反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因 素少，试剂稳定性好，可W两点定标，体系简单，激发液成本低，叮晚醋易与蛋白质联结，且 联结后光子产率不减少。

【发明内容】

[0010] 基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制 备方法。
[0011] -种肾素化学发光免疫检测试剂盒，包括:肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微 粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
[0012] 在一个实施例中，所述肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒中，所述肾素单克 隆抗体与所述簇基化的磁微粒的比例为1:25~35。
[0013] 在一个实施例中，所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，所述肾素单 克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为50:1~10。
[0014] 在一个实施例中，所述簇基化的磁微粒的粒径为0.05皿~1皿。
[0015] 在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、=联化晚钉或叮晚 醋。
[0016] 在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。 [0017]在一个实施例中，所述A液为出〇2溶液，所述B液为NaO田容液。
[0018] 在一个实施例中，还包括肾素定标品。
[0019] 在一个实施例中，所述肾素定标品为浓度分别为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、 500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的肾素的溶液。
[0020] -种上述的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 取簇基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入抓C水溶液， 活化簇基化的磁微粒的表面簇基，接着加入肾素单克隆抗体，室溫下混悬化~1化，磁分离去 除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒;W及 取肾素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室溫 下避光反应化~化后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
[0021] 运种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够W全自动化学发光免疫分析仪为检测工 具，完成肾素的检测运种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到Ipg/ mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了 10倍，运种肾素化学发光免疫检测试 剂盒的检测精度较高。
[0022]
【附图说明】
[0023] 图1为一实施方式的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程图； 图2为实施例3得到的肾素标准曲线图。
[0024]
【具体实施方式】
[0025] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节W便于 充分理解本发明。但是本发明能够W很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可W在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施 的限制。
[00%] -实施方式的肾素化学发光免疫检测试剂盒，包括：肾素单克隆抗体包被的簇基 化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
[0027] 优选的，肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒中，肾素单克隆抗体与簇基化的 磁微粒的比例为1:25~35。
[0028] 优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，肾素单克隆抗体与化学发 光标记物的比例为50:1~10。
[0029] 优选的，簇基化的磁微粒的粒径为0.05皿~1皿。
[0030] 化学发光标记物可W为鲁米诺、异鲁米诺、=联化晚钉或叮晚醋。其中，化学发光 标记物优选为叮晚醋。
[0031] 在其他的实施例中，上述肾素化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液。
[0032] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可W为也化溶液，B液可W为NaO田容液。
[0033] 本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的也〇2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的化OH溶 液。
[0034] 在其他的实施例中，上述肾素化学发光免疫检测试剂盒还包括肾素定标品。
[0035] 肾素定标品为浓度分别为化旨/1111^、5化旨/1111^、200口旨/1111^、50化旨/1111^、100化旨/1]1巧口 1600pg/mL的肾素的溶液。
[0036] 具体的，肾素定标品可W采用标准品缓冲液将肾素配制成浓度分别为Opg/mL、 50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的肾素的溶液。
[0037] 运种肾素化学发光免疫检测试剂盒用于肾素检测时，利用全自动化学发光免疫分 析仪对肾素定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件;接着测试实际样本，根据样 本发光值计算样本浓度；最后对肾素全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线 性、精密度、干扰性)的评价。
[0038] 运种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够W全自动化学发光免疫分析仪为检测工 具，完成肾素的检测运种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到Ipg/ mL，相对于传统的肾素的检测方法灵敏度至少提高了 10倍，运种肾素化学发光免疫检测试 剂盒的检测精度较高。
[0039] 此外，运种肾素化学发光免疫检测试剂盒还具有W下优点： 1、 选择叮晚醋作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化 学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本； 2、 选用叮晚醋的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到lpg/ni~ lOOOpg/mL，而传 统的肾素的检测方法的检线性范围为10pg/nO^~ 800pg/mL 3、 叮晚醋化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%W内，运是其它化学 发光免疫分析系统难W达到的； 4、 化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测 试样本就可直接得到样本的浓度值； 5、 化学发光免疫分析系统可W实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作 更加简便，减少了人为的误差。
[0040] 如图1所示的上述肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 取簇基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入抓C水溶液， 活化簇基化的磁微粒的表面簇基，接着加入肾素单克隆抗体，室溫下混悬化~1化，磁分离去 除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒。
[0041 ] MES(2-(N-吗啡嘟）乙横酸)缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
[0042] Tris缓冲液的浓度为0.1 M并且含有2%BSA，pH为8.0。
[0043] 抓C(l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺）水溶液的浓度为10mg/W^~20mg/ mL，邸C与簇基化的磁微粒的比例为0.05:0.1~1。
[0044] 优选的，肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒中，肾素单克隆抗体与簇基化的 磁微粒的比例为1:25~35。
[0045] 优选的，簇基化的磁微粒的粒径为0.05]im~1皿。
[0046] 取肾素单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀， 室溫下避光反应化~化后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
[0047] 碳酸盐缓冲液浓度为0. lM，pH为9.0~9.5， 除杂的操作为离屯、脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液（40 ml 化is-HCl ,0.5% BSA，1%化Cl, pH 8.0)处理离屯、脱盐柱，最后加入得到的肾素单克隆抗体 包被的簇基化的磁微粒的溶液，最后收集离屯、管中的液体。
[0048] 优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，肾素单克隆抗体与化学发 光标记物的比例为50:1~10。
[0049] 化学发光标记物可W为鲁米诺、异鲁米诺、=联化晚钉或叮晚醋。其中，化学发光 标记物优选为叮晚醋。
[0050] 得到的肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学 发光标记物组合即可得到上述肾素化学发光免疫检测试剂盒。
[0051] 运种肾素化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物液和肾素定标 品。
[0052] 化学发光底物液和肾素定标品可W自行配制得到。
[0053] 化学发光底物液包括A液和B液。A液可W为出化溶液，B液可W为NaO田容液。
[0054] 本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的出〇2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的化OH溶 液。
[0055] 具体的，肾素定标品可W采用标准品缓冲液将肾素配制成浓度分别为Opg/mL、 50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的肾素的溶液。
[0056] 运种肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的肾素化学发光免 疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
[0化7] W下为具体实施例。
[0058] 实施例1:肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备 (1)肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微粒的制备： 取含有50mg粒径为0.05皿~1皿的簇基化的磁微粒(MagnaBind21353)悬浮液，磁分离去 上清，用0.02 M，抑为5.5 MES缓冲液重悬，加入ImL新配置的1 Omg/mL的抓C水溶液，活化磁 珠表面簇基，加入4mg肾素单克隆抗体(biorbyt，货号o;rb48780)，室溫下混悬化，磁分离，去 除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的化is缓冲液重悬到Img/mL，得到肾素单克隆抗体包被 的簇基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0059] (2)抑制素单克隆抗体标记的叮晚醋的制备： 取50化浓度为25mg/mL的肾素单克隆抗体，加入15化L浓度为0.1M、pH为9.0~9.5的碳酸 盐缓冲液，混匀，然后加入1.扣L浓度为5mg/血的日丫晚醋溶液混匀，室溫下避光反应，1.化后 取出，用2mL的zeba离屯、脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行 处理，最后加入得到的抑制素单克隆抗体标记的叮晚醋溶液，收集离屯、管中的液体至保存 管得到抑制素单克隆抗体标记的叮晚醋，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0060] (3)肾素定标品的制备： 用标准品缓冲液(40 mM Tris-肥1,0.5% BSA，1%化Cl,pH 8.0)将肾素配置成浓度为 0pg/mL、50 Pg /血、200pg /血、500 Pg /mL、1000 Pg /mL和 1600 Pg /mL,每瓶0.5 血分装 冻干，4 °C保存备用。
[0061] 实施例2:肾素化学发光免疫检测方法 W全自动化学发光免疫分析仪(Y化0,货号iFlash3000)为检测工具，方法学模式为双 抗体夹屯、法，即仪器依次加入50化的样品、50化的肾素单克隆抗体包被的簇基化的磁微 粒W及50 JiL的肾素处理液，反应20 min后，再加50 JiL的肾素包被的叮晚醋，反应20 min 后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液(也化)及B液(化OH)进 行发光反应，最后记录发光值。
[0062] 实施例3:肾素化学发光免疫检测试剂盒性能评价 采用实施例2中的方法对肾素定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图2所示。
[0063] 接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
[0064] 灵敏度的检测： 参照化SI EP17-A文件推荐实验方案，计算肾素化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度， 求得的灵敏度为Ipg/ mL。
[00化]线性的检测： 对浓度为I pg /mL、50 pg /mL、200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL标准品做线性分 析，计算线性相关系数，r=0.9996,另外，该试剂盒对肾素样品检测的线性范围为Ipg/ml~ lOOOpg/mLo
[0066] 精密度测定： 取浓度为10化g/mL及lOOOpg/mL两个肾素样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用S 批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
[0067] 干扰性实验： 取混合血清分别添加干扰物包括:结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油 醋，添加比例按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值， 计算二者之间的偏差，W ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标 准，可用于临床实验室肾素状况的准确评估。
[006引 实施例4、肾素化学发光免疫检测试剂盒的对比实验 分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为1 Pg /mL、50 Pg /mU 200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL、1600 pg /mL的肾素样品做检测，两种方法检测灵敏 度相比，数据如下表所示：
由上表可W看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约10倍。
[0069] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括:肾素单克隆抗体包被的羧基 化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。2. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述肾素单克隆 抗体包被的羧基化的磁微粒中，所述肾素单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为1:25 ~35〇3. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抑制素单克 隆抗体标记的化学发光标记物中，所述肾素单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为 50:1~10〇4. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁 微粒的粒径为〇. 〇 5μηι~1 μL?。5. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标 记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联啦啶舒或吖啶酯。6. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光 底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。7. 根据权利要求6所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述A液为H2O2溶 液，所述B液为NaOH溶液。8. 根据权利要求1所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括肾素定标 品。9. 根据权利要求8所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述肾素定标品 为浓度分别为 0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL 和1600pg/mL的肾素的溶 液。10. -种根据权利要求1~9中任一项所述的肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备方法， 其特征在于，包括如下步骤： 取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入肾素单克隆抗体，室温下混悬2h~10h，磁分离去 除上清后用Tris缓冲液重悬，得到肾素单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒；以及取肾素单 克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应Ih ~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
【文档编号】G01N33/543GK105954509SQ201610506923
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】冯丽珠, 夏福臻, 钱纯亘, 王刚, 祝亮
【申请人】深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司