0s，72°C60s，5 个循环；
[0039] 95°C30s，54-56°C90s，72°C60s，30 个循环；
[0040] 72°C 延伸 3min;
[00411上述热循环的升降温度为2.5°C/s。
[0042] 本发明试剂盒的多重PCR反应体系为：Qiagen Multiplex PCR Master Mix (Qiagen，Hilden，Germany) 10μ1，引物预混液（10 X )2μ1，内对照质粒pMD18T_IAC( 104-105copies/yl) ΙμL，样本核酸2μ1，去离子水5μ1，总反应液体积为20μ1。
[0043] 本发明试剂盒的多重PCR结果以具有高分辨率的毛细管电泳设备进行分析，例如， 在QIAxcel设备上以DNA High Resolution kit进行片段分析，DNA Alignment Marker 15bp/600bp和size marker 25bp/500bp用来确定片段大小。
[0044] 本发明试剂盒还含有内对照质粒pMD18T_IAC 104-105拷贝。
[0045] 所述内对照质粒pMD18T-IAC为全基因合成的核酸片段(GenBank号FJ357008.1，参 考文南犬Deer DM，Lampel KA,Gonzalez-Escalona N.2010.A versatile internal control for use as DNA in real-time PCR and as RNA in real-time reverse transcription PCR assays .Lett Appl Microbiol50:366-372·)克隆到载体质粒pMD18_T而制备。
[0046] 本发明借鉴GeXP平台的引物策略设计一套引物用于病原菌的检测;对扩增产物的 分析，本发明可使用任何高分辨率(条带大小差异5bp以上可以区分）的电泳技术，此处以 QIAxcel设备应用DNA High Resolution kit为例进行说明。
[0047]在GeXP平台建立的检测方法，所查阅到的所有文献均采用通用引物对？：5'_ AGGTGACACTATAGAATA-3 ' ； R: 5 ' -GTACGACTCACTATAGGGA-3 '。但是在本发明的研究过程中发 现，这对通用引物用于肠道细菌检测时，由于其与肠道细菌的核酸序列有一定同源性，容易 导致非特异性条带的产生，影响对结果的正确判断。本发明通过筛选新的通用引物，获得了 稳定的扩增效果。
[0048] 本发明针对12种腹泻病原菌设计的检测其毒力基因或种属特异性基因的特异性 嵌合引物，避免了引物自身形成二级结构，避免了错配及非特异性片段出现;多重PCR体系 中，设计引物序列时，还考虑到使上下游引物的TM值尽可能地接近、每种扩增产物大小在 100bp-500bp之间且大小相差5bp以上。采用低浓度的特异性嵌合引物与高浓度的通用引物 相结合的扩增策略，能极大降低多重PCR中存在的扩增偏爱性的影响，使结果更可靠。
[0049] 本发明通过设置多重不对称PCR体系，优化反应体系的配置、PCR反应的温度、时间 等，实现了对12种腹泻病原菌的准确检测。本发明在单个PCR扩增体系中可以同时检测15个 靶标，覆盖了 12类常见腹泻病原菌，使病原菌的筛查更简便、更广谱；以全自动毛细管电泳 分析扩增产物，结果更易于判断；加入PCR扩增内对照，可识别样本中扩增抑制因素导致的 假阴性。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，对临床腹泻 样本中常见病原菌的初筛和腹泻病的流行病学调查，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0050] 图1为仅含有一种靶基因的标准质粒为模板时，本发明的16重PCR体系扩增产物的 QIAxcel毛细管电泳图。各泳道条带大小与对应的靶基因分别为，泳道l，369bp，EPEC的bfpA 基因；泳道 2，274bp，EPEC 的 eaeA 基因；泳道 3，485bp，ETEC 的 elt 基因；泳道 4，214bp，ETEC 的 stp 基因；泳道 5，191bp，ETEC 的 sth 基因；泳道 6，225bp，EHEC 的 stxl 基因；泳道 7，465bp，EHEC 的stx2基因；泳道8，299bp，EAEC的aggR基因；泳道9，260bp，EIEC或志贺氏菌的virA基因；泳 道10，249bp，沙门菌的ompC基因；泳道11，389bp，结肠弯曲菌的ceuE基因；泳道12，424bp，空 肠弯曲菌的hipO基因；泳道13,396bp，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因；泳道14,354bp，霍 乱弧菌的ompW基因；泳道15，413bp，副溶血弧菌的toxR基因。
[0051 ]图2为致泻性大肠杆菌的菌株核酸为模板时，16重PCR体系扩增产物的QIAxcel毛 细管电泳图。各泳道条带大小与对应的菌株模板分别为，泳道1，299bp (aggR阳性），模板为 EAEC;泳道2,485bp(elt阳性），214bp(stp阳性），191bp(sth阳性）；模板为ETEC;泳道3， 369bp(bfpA阳性），274bp(eaeA阳性）；模板为EPEC;泳道4,260bp(virA阳性）；模板为EIEC; 泳道5，465bp(stx2阳性），274bp(eaeA阳性），225bp(stx 1阳性）；模板为EHEC;泳道6，分子量 marker〇
【具体实施方式】
[0052]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0053]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0054]实施例1特异性嵌合引物的设计
[0055]通过查阅0ΙΕ、国标、行标和相关文献，确定12种常见腹泻病病原的致病基因或种 属特异性基因，即大肠杆菌EPEC的bfpA基因、eaeA基因，大肠杆菌ETEC的elt基因、stp基因、 sth基因，大肠杆菌EHEC的stxl、stx2基因，大肠杆菌EAEC的aggR基因，大肠杆菌EIEC的virA 基因，志贺氏菌的virA基因，沙门氏菌的ompC基因，空肠弯曲菌的hipO基因，结肠弯曲菌的 ceuE基因，霍乱弧菌的ompW基因，副溶血弧菌的toxR基因，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基 因。查阅文献与各种资料，引用现有的或自行设计针对以上基因的引物序列。进行引物设计 时，在GenBank数据库下载相关核酸序列，利用DNAStar、Primer Premier 5.0等软件选取其 中保守区域设计引物。除一般的引物设计原则外，根据以下标准筛选出15对引物：（1)扩增 产物大小在l〇〇bp_500bp之间；（2)不同扩增产物大小相差9bp以上。并将SEQ ID N0.31-32 所示的内参引物分别嵌合入上述15对特异性引物的5'端，得到15对特异性嵌合引物，核苷 酸序列分别如SEQ ID N0.1-30所示。由此，本发明首先提供了一种同时检测上述12种腹泻 病原菌的特异性嵌合引物对组合，序列如表1。表1中引物从上到下分别对应序列表中的SEQ ID NO.1-32〇 [0056] 表1引物序列
[0057]
[0058]
[0059] 注：f*是指在特异性引物的5'段连接内参引物IAC-f的序列得到特异性嵌合上游 引物，r*是指在特异性引物的5'段连接内参引物IAC-r的序列特异性嵌合下游引物。
[0060] 在GeXP平台建立的检测方法，所查阅到的所有文献均采用通用引物对？：5'_ AGGTGACACTATAGAATA-3 ' ； R: 5 ' -GTACGACTCACTATAGGGA-3 '。但是在本发明的研究过程中发 现，这对通用引物用于肠道细菌检测时，由于其与肠道细菌的核酸序列有一定同源性，容易 导致非特异性条带的产生，影响对结果的正确判断。本发明通过选择其它的通用引物，获得 了稳定的扩增效果。
[0061] 引物是多重PCR的关键因素，本发明在设计引物时，（1)首先应该在保守性高的核 苷酸片段中选择特异性较高的引物，但本发明设计引物的同时，不仅考虑了每种腹泻病原 之间的高度保守区，且保守区中能同时代表腹泻病原的特异性片段，而且还必需保证每段 高度保守区之间的特异性，这样不同的腹泻病原片段才易区分开。
[0062] (2)避免引物之间形成二级结构，例如自身发夹结构、上下游引物之间或者是引物 与探针之间形成二聚体，同时引物避免与靶基因错配，如果一个引物与靶基因多个地方结 合，会造成非特异性片段出现。
[0063] (3)引物的3'端必需保持高度保守，在退火过程中，引物的3'端是开始延伸的地 方，这样才能进行最大效率的复制。
[0064] (4)Tm值为设计引物的重要决定因素，为引物的最佳退火温度提供参考数据，上下 游引物的Tm值应可能的接近，同时考虑到12种腹泻病原的所有上下游引物Tm值最多不能超 过l〇°C，为多重PCR做准备。
[0065] (5)由于同时检测的病原较多，每种腹泻病原都需