设计1对或多对引物，还要避免 15对引物之间、引物对与模板之间、内参引物与特异性嵌合引物之间、内参引物与不同PCR 产物之间的交叉反应，最终从中筛选出表1中的最佳引物对组合。
[0066] 实施例2同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR检测体系的建立
[0067] 1、多重PCR检测模板的制备
[0068] (1)标准质粒的构建：以特异性嵌合引物的3'端部分（即嵌合引物序列去除通用引 物序列后的部分)扩增相应病原菌的核酸DNA，扩增产物连接载体质粒pMD19-T Simple，以 E.Coli JM109为宿主菌，构建标准质粒。针对15个检测靶标，共构建15种标准质粒。
[0069] (2)标准质粒的提取与浓度测定：以QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen， Hi 1 den,Germany)自携带标准质粒的宿主菌培养物中提取质粒；以超微量分光光度计 NanoDrop ND-1000对核酸溶液进行浓度测定。
[0070] (3)标准质粒拷贝数的计算：每微升质粒溶液中含有的质粒拷贝数为：（6.02 X 1023) X (ng/μL X 10-9)/ (质粒碱基数 X 660)。
[0071] (4)标准质粒倍比稀释物的制备:根据各标准质粒的浓度，以去离子水将标准质粒 按10倍比例进行倍比稀释，制备ιοΜο 8拷贝AU的溶液。
[0072] 2、多重PCR体系的优化
[0073] (1)对特异性嵌合引物以及内参引物的浓度进行优化。首先采用特异性嵌合引物 各50ηΜ、内参引物500ηΜ的浓度对标准质粒的系列稀释物进行扩增和检测；在Qiaxcel毛细 管电泳中，根据s i ze marker的大小和浓度对扩增产物的大小、产量进行定量。对于灵敏性 较低、PCR产物的产量明显低于其它靶标的引物，上调其浓度;对于灵敏性高、PCR产物产量 较高的引物，下调其浓度。通过多次尝试和对比，最终确定PCR反应液中15对特异性嵌合引 物和1对内参引物的浓度见表1。
[0074] 表 1
[0075]
[0076] (2)对热循环参数进行优化。首先按照Qiagen Multiplex PCR Master Mix的使用 说明，设置多重PCR反应条件为:95°C预变性15min; 95°C30s，60°C90s，72°C60s，40个循环； 72°C延伸3min。为促进特异性引物与模板的结合，将热循环的升降温度速度设置为2.5°C/ s。对标准质粒检测中发现，有时会有非特异性条带产生;为提高扩增的特异性，减少特异性 嵌合引物与非模板序列的结合，采取了temperature switch PCR的方式，采用三个退火温 度，分别用于特异性嵌合引物3'端部分与模板的退火、特异性嵌合引物全长与模板的退火、 内参引物与模板的退火。第一和第二阶段的退火温度较高，有利于提高引物与模板结合的 特异性，减少非特异性扩增;第三阶段的退火温度较低，有利于提高PCR产物的产量，提高检 测灵敏性。
[0077] 在引物浓度优化过程中，采用的热循环参数为：
[0078] 95°C 预变性 15min;
[0079] 95°C30s，60°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0080] 95°C30s，65°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0081 ] 95°C30s，55°C90s，72°C60s，30 个循环；
[0082] 72°C 延伸 3min。
[0083] 确定引物浓度后，本发明对比了多种退火温度的结果，发现在以下温度范围内，扩 增结果没有明显差异：
[0084] 95°C 预变性 15min;
[0085] 95°C30s，58-62°C90s，72°C60s，40 个循环；
[0086] 95°C30s，64-68°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0087] 95°C30s，54-56°C90s，72°C60s，30 个循环；
[0088] 72°C 延伸 3min;
[0089] 3、多重PCR体系的建立
[0090] 本发明的试剂盒中，多重PCR反应各引物在引物预混液(10X )及PCR反应液中的浓 度分别见表2:
[0091] 表2
[0092]
[0093]
[0094] 本发明试剂盒的多重PCR反应体系为：Qiagen Multiplex PCR Master Mix (Qiagen，Hilden，Germany) 10μ1，引物预混液（10 X )2μ1，内对照质粒pMD18T_IAC( 104-105copiesAU)lyl，样本核酸2μ1，去离子水5μ1，总反应液体积为20μ1。
[0095] 本发明试剂盒的多重PCR反应条件为:95°C预变性15min;
[0096] 95°C30s，58-62°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0097] 95°C30s，64-68°C90s，72°C60s，5 个循环；
[0098] 95°C30s，54-56°C90s，72°C60s，30 个循环；
[0099] 72°C 延伸 3min;
[0100] 上述热循环的升降温度为2.5°C/S。
[0101] 4、检测结果的判定
[0102] 如图1所示，多重PCR扩增产物在QIAxcel设备上以DNA High Resolution kit进行 片段分析，DNA Alignment Marker 15bp/600bp和size marker 25bp/500bp用来确定片段 大小。各泳道条带大小与对应的靶基因分别为，泳道1，369bp，EPEC的bf pA基因；泳道2， 274bp，EPEC 的 eaeA 基因；泳道 3，485bp，ETEC 的 elt 基因；泳道 4，214bp，ETEC 的 stp 基因；泳道 5，191bp，ETEC的sth基因；泳道6,225bp，EHEC的stxl基因；泳道7,465bp，EHEC的stx2基因 ； 泳道8，299bp，EAEC的aggR基因；泳道9，260bp，EIEC或志贺氏菌的virA基因；泳道10，249bp， 沙门菌的ompC基因；泳道11，389bp，结肠弯曲菌的ceuE基因；泳道12，424bp，空肠弯曲菌的 hipO基因；泳道13,396bp，小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因；泳道14,354bp，霍乱弧菌的 ompW基因；泳道15,413bp，副溶血弧菌的toxR基因。
[0103]实施例3同时检测12种腹泻病原菌的多重PCR的特性验证
[0104] 1、特异性实验
[0105] 279个菌株用于验证本发明的特异性，包括属于本发明检测范围的207株菌:43株 霍乱弧菌、20株副溶血弧菌、6株空肠弯曲菌、6株结肠弯曲菌、24株沙门菌、10株志贺氏菌、5 株EIEC、19株EAEC、26株EPEC、45株ETEC和2株EHEC;不属于本发明检测范围的72株菌:40株 非致病性大肠杆菌、18株气单胞菌、6株拟态弧菌、6株河弧菌、1株创伤弧菌和1株迟缓爱德 华菌。对于霍乱弧菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、沙门菌、EIEC&志贺菌和EAEC， 除内参对照条带（145bp)之外，只有一个电泳条带被检测到，且条带大小与设计的扩增产物 大小相符。26株EPEC，3株EHEC和45株ETEC均有1-3个扩增产物被检测到，符合相应病原菌的 检出标准。72株不属于本发明检测范围的菌株，均只有内参对照145bp条带产生。
[0106] 如图2所示，为致泻性大肠杆菌的菌株核酸为模板时，16重PCR体系扩增产物的 QIAxcel毛细管电泳图。
[0107] 2、灵敏度实验
[0108]将携带靶基因的标准质粒系列稀释液(ΙΟΜΟ8拷贝/μL)作为模板，以16重PCR体系 进行检测，发现16重PCR体系对每种靶标基因的检测灵敏度为：对靶标基因空肠弯曲菌 ceuE、结肠弯曲菌hipO、副溶血弧菌toxR和EHEC的stx2，灵敏度为5000拷贝/反应;对其它靶 标基因的灵敏度为500拷贝/反应。
[0109] 3、准确性实验
[0110] 对上述特异性实验中使用的菌株，用现有技术已报道的上述各菌株的单重荧光 PCR体系进行检测，检测结果与本发明的结果一致。说明本发明同时检测12种腹泻病原菌的 方法准确度高，达到100 %。
[0111] 实施例4同时检测12种腹泻病原菌的方法的临床应用
[0112]自江苏无锡的医院门诊采集有腹泻症状患者的粪便样本共243份，每份取200mg， 在 MagNA Pure LC 2.0 设备（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)以 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit提取核酸，或手工以QIAmp Stool Mini Kit提取核 酸。两种方法都以50μ1洗脱液洗脱核酸。扩增内对照的模板质粒PMD18T-IAC为全基因合成 200bp的DNA片段并连接到载体pMD18-T而