专利名称：一种检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测 脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法。
背景技术：
酸性a-醋酸萘酯酶染色技术原理为T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解a-醋 酸萘酯，产生a-萘酚，a-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在 含有该酶的细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀。早在上个世纪六十年代，就有人研究了正常宫颈、宫颈癌前病变及宫颈鳞状细胞 癌组织中若干酶的组织化学表达情况，在冰冻切片中，宫颈癌和癌旁组织中某些酶远比正 常组织高。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向 染色试剂盒及其使用方法；利用酸性a“醋酸萘酯酶染色法靶向性检测宫颈脱落细胞中的 a萘酚酯酶酶，从而有针对性地显示脱落细胞中增生活跃及潜在异型增生的细胞群。本发明的基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，基试 剂包括
试剂A 酶固定液50ml/瓶1瓶；所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为 6. 6，配制为称取lOOmg的KH2P04和20mg的Na2HP04,先溶解于30ml水中，然后加入45ml 丙酮和4% (重量比，下同)甲醛水溶液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6. 6，置4°C冰 箱中保存；分装50ml/瓶；
试剂B 采用10ml的棕色塑料滴瓶内装0. 3ml色素基质(1)，共5瓶；所述试剂B的色 素基质(1)为新品红或副品红溶液，配制为称取4g新品红或副品红加入到100ml浓度为 2mol/L的HC1水溶液中，40 60°C水浴直至新品红或副品红溶解，用滤纸过滤后，置4°C冰 箱中保存；分装10ml棕色塑料滴瓶，每瓶分装0. 3ml ；
试剂C 色素基质(2)2ml/瓶，1瓶；所述试剂C的色素基质(2)为重量比为1 10%的 亚硝酸钠水溶液，分装棕色塑料滴瓶2ml/瓶；
试剂D 酶底物3ml/滴瓶1瓶；所述试剂D的酶底物为重量比为1 5%的a -醋酸 萘酯溶液称取2ga -醋酸萘酯溶于100ml丙酮中，置4°C避光保存；分装棕色塑料滴瓶， 3ml/滴瓶；
试剂E :pH7.6磷酸缓冲液200ml/瓶1瓶；所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为 l/15mol/L, pH为5. 7 8. 0 称取KH2P049 . 08g溶于1000ml蒸馏水中，该液为A液；称取 Na2HP04 '12H2023. 882g溶于1000ml蒸馏水中，为B液，以A液13ml与B液87ml混勻即可； 分装塑料瓶，200ml/瓶。
迈尔苏木素染液50ml/瓶，1瓶；所述迈尔苏木素染液将苏木素0. lg放入蒸馏水 100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g和碘酸钠0. 02g，搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛 5g和枸椽酸0. lg,继续煮沸3-lOmin，冷却、过滤，放置16 20小时，即可使用；分装取50ml 滴瓶，每瓶装量50ml。使用上述基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒检测 宫颈细胞的方法，依次包括以下步骤
(1)预制染色孵育液
取试剂BO. 1 0. 5ml，滴入0. 1 0. 5ml试剂C，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂DO. 2 0. 4ml，轻轻摇晃后再加入试剂E8 10ml，即成孵育液；该液体为一次性使用，配置后应在1 小时内用完；剩余液体应废弃，不可留用；
(2)染色方法
①细胞抹片采用液基细胞的自然沉降法制备宫颈细胞抹片，待细胞最终在沉降孔内 自然沉降10分钟后加入试剂A300-800微升，1分钟后l-2min倾去液体；
②加入蒸馏水300-1000微升水洗20 50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接 滴入孔内，一次滴入6滴(0. 3ml)，于室温下放置5-15分钟；
③倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入300-1000微升蒸馏水，洗2-3遍；
④加入迈尔苏木素染液300-1000微升，2-8分钟后倾去迈尔苏木素染液；
⑤再在载有细胞的孔内加入试剂E300-1000微升，放置20-60s；
⑥梯度酒精脱水，风干后用中性树胶封固；得到染色涂片；于显微镜下观察。本发明的试剂盒储存2-8 °C保存，保质期6个月。(3)结果分析
本发明的试剂盒检测的可表现阳性的宫颈细胞归类如下
1.异常细胞呈棕红色细颗粒，不规则分布于胞浆中
HPV感染的细胞，如图1所示；
不典型鳞状细胞-不明意义(ASC-US)，如图2所示；
不典型鳞状细胞_倾向高度病变(ASC-H)，如图3所示；
低度病变细胞(LSIL)，如图4所示；
高度病变细胞(HSIL)，如图5所示；
鳞状细胞癌，如图6所示。2.正常及反应性细胞
正常成熟鳞状细胞阴性，如图7所示； 宫颈柱状细胞棕色颗粒弥漫均勻分布，如图8所示； 化生细胞棕红色颗粒弥漫均勻分布，如图9所示； 修复反应细胞较稀疏均勻的棕红色细小颗粒，如图10所示； 组织细胞偶见，呈棕红色颗粒，容易识别，如图11所示。3.微生物
念珠菌鲜艳的浅棕色，如图12所示。本发明的显著优点
1、本发明的的染色液对增生细胞的敏感性较高，核大细胞比常规巴氏染色明显易见，尤其是各种炎性修复反应的鳞状细胞亦可呈阳性，可从形态学上予以区别，达到提高阳性 检出率、降低假阴性、提高效率的目的。2、化生细胞和高度病变的细胞的鉴别，在液基细胞学中是一个难题，由于技术原 因，其核的微细结构不易察看清楚。本发明主要依据核的改变来辨别，能清楚地显示那些少 量散在甚至是个别存在的不典型鳞状细胞。
图1是HPV感染的细胞(典型或不典型的挖空细胞)； 图2为不典型鳞状细胞-不明意义(ASC-US)；
图3为不典型鳞状细胞-倾向高度病变(ASC-H)；
图4为低度病变细胞(LSIL)；
图5为高度病变细胞(HSIL)；
图6为鳞状细胞癌；
图7为正常成熟鳞状细胞阴性；
图8为宫颈柱状细胞棕色颗粒弥漫均勻分布；
图9为化生细胞棕红色颗粒弥漫均勻分布；
图10为修复反应细胞较稀疏均勻的棕红色细小颗粒；
图11为组织细胞；
图12为念珠菌。
具体实施例方式本发明的基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，其试 剂组成包括
试剂A 酶固定液，50ml ；所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为6. 6，配 制为称取lOOmg的KH2P04和20mg的Na2HP04，先溶解于30ml水中，然后加入45ml丙酮和 4% (重量比，下同)甲醛水溶液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6. 6，置4°C冰箱中保 存；
试剂B 采用10ml的棕色塑料滴瓶内装0. 3ml色素基质(1)；所述试剂B的色素基质 (1)为新品红或副品红溶液，配制为称取4g新品红或副品红加入到100ml浓度为2mol/L 的HC1水溶液中，40 60°C水浴直至新品红或副品红溶解，用滤纸过滤后，置4°C冰箱中保 存；
试剂C 色素基质(2)，2ml ；所述试剂C的色素基质(2)为重量比为4%的亚硝酸钠水溶
液；
试剂D 酶底物，3ml ；所述试剂D的酶底物为重量比为2%的a -醋酸萘酯溶液称取 2ga-醋酸萘酯溶于100ml丙酮中，置4°C避光保存；
试剂E :pH7. 6磷酸缓冲液，200ml ；所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为l/15mol/L，pH为 7. 6 称取KH2P049 . 08g溶于1000ml蒸馏水中，该液为A液；称取Na2HP04 12H2023. 882g溶 于1000ml蒸馏水中，为B液，以A液13ml与B液87ml混勻即可；
迈尔苏木素染液50ml ；所述迈尔苏木素染液将苏木素0. lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g和碘酸钠0. 02g,搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸 0. lg，继续煮沸5min，冷却、过滤，放置16 20小时，即可使用。使用上述基于酸性a -醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒检测 宫颈细胞的方法，依次包括以下步骤
(1)预制染色孵育液
取试剂C，滴入6滴(0. 3ml)试剂C到试剂B滴瓶(含0. 3ml试剂B)中，轻轻摇晃，3分 钟后加入试剂D4-8滴(0. 2-0. 4ml)，轻轻摇晃后再加入试剂E9ml，即成孵育液；该液体为一 次性使用，配置后应在1小时内用完；剩余液体应废弃，不可留用；
(2)染色方法
①细胞抹片采用液基细胞的自然沉降法制备宫颈细胞抹片，待细胞最终在沉降孔内 自然沉降10分钟后加入试剂A500微升，1分钟后倾去液体；
②加入蒸馏水500微升水洗20 50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入 孔内，一次滴入6滴(0. 3ml)，于室温下放置5-15分钟；
③倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入500微升蒸馏水，洗2-3遍；
④加入迈尔苏木素染液500微升，2-8分钟后倾去迈尔苏木素染液；
⑤再在载有细胞的孔内加入试剂E500微升，放置30秒；
⑥分别采用重量比为95%的乙醇水溶液和100%乙醇脱水，风干后用中性树胶封固；得 到染色涂片；于显微镜下观察。以下为本发明的具体实施案例，进一步描述本发明，但是，本发明不仅限于此。实施例1正常人宫颈细胞检测
(1)预制染色孵育液
取试剂c，滴入6滴(0. 3ml)试剂C到试剂B滴瓶(含0. 3ml试剂B)中，轻轻摇晃，3分 钟后加入试剂D4-8滴(0. 2-0. 4ml)，轻轻摇晃后再加入试剂E9ml，即成孵育液；
(2)染色方法
①细胞抹片取健康人的宫颈体液样品约12ml，先以1080rpm离心2min，去除上清液 余4ml，再以2000rpm离心lOmin，去掉上清液，加入试剂ElOOOul，混勻，取混勻的细胞悬液 500ul移至涂有细胞贴附剂的载玻片，自然沉降，待细胞最终在沉降孔内自然沉降10分钟 后加入试剂A500微升，1分钟后倾去液体；
②加入蒸馏水500微升水洗30s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内， 一次滴入6滴(0. 3ml),于室温下放置12分钟；
③倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入500微升蒸馏水，洗2遍；
④加入迈尔苏木素染液500微升，5分钟后倾去迈尔苏木素染液；
⑤再在载有细胞的孔内加入试剂E500微升，放置30秒；
⑥分别采用重量比为95%的乙醇水溶液和100%乙醇脱水，风干后用中性树胶封固；得 到染色涂片；于显微镜下观察。(3)结果分析
如图7所示，显示正常成熟鳞状细胞，呈阴性，无棕红色阳性颗粒。实施例2宫颈CIN组织中检测酯酶活性 (一)方法宫颈cmi—in级锥切手术的新鲜标本，在恒冷箱冰冻切片机中切片，5微米厚。切片 滴入试剂A6滴固定5分钟，4° C备用。为获得准确结果，连续收集了 10例共50张切片供 酯酶染色。1、切片恢复室温，用蒸馏水洗30秒，吸干组织周围水分。2、取试剂C6滴，滴入到试剂B滴瓶中，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂D4滴，轻轻 摇晃后再加入试剂E9ml即成孵育液。每片滴入孵育液，至孵育液淹没组织切片，室温下孵 育10分钟.
3、流水冲洗去孵育液后，再用蒸馏水洗1分钟，三次。4、滴加迈尔苏木素染液至淹没组织切片，2分钟。5、水洗返兰，系列酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察。(二)结果
宫颈鳞状上皮内瘤变区域显示酯酶呈深棕色一浅棕红色，尤其在邻近表层细胞部位， 显示强烈的阳性，而非瘤变区域，仅见个别散在的阳性细胞，一些挖空细胞，在其胞浆增厚 部亦有明显的阳性轮廓，有的染色深，有的仅有一圈淡淡的浅棕红色晕。在宫颈瘤变粘膜下 层的间质里，可见到许多富含酯酶的组织细胞。(三)小结
宫颈鳞状上皮瘤变区域可见丰富的酯酶存在，而非瘤变区域基本阴性，结果支持了宫 颈脱落细胞酯酶检测有助于上皮病变细胞的发现。实施例3宫颈液基细胞中检测酯酶活性 (一)方法
1、标本连续性120例妇科门诊送检的液基细胞标本，离心、自然沉降制片，每例制成 两片，一片按传统巴氏染色，另一片按本发明方法作酯酶染色(见步骤2)
2、酯酶染色
(1) 细胞沉降后往沉降孔滴入试剂A6滴，5分钟后倾去A固定液。(2) 加入蒸馏水6滴，1分钟后倾去液体。(3)配制酯酶孵育液取试剂C6滴，滴入到试剂B滴瓶中，轻轻摇晃，3分钟后 加入试剂D4滴，轻轻摇晃后再加入试剂E9ml即成孵育液。每孔滴入孵育液，室温下孵育10 分钟.
(4)、倾去染色液，加入约500微升试剂E，洗2遍。(5)、加入Mayer苏木素染液500微升，2_8分钟后倾去染液。(6)、加入试剂E500微升30秒，如是2次。(7)、95%、100%酒精脱水，风干后用中性树胶封固。3、阳性判断
阴性鳞状表层、中、底层细胞无显示色。阳性+ :鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈浅棕红色，有时仅在细胞边缘出现淡棕红 色晕或不规则着染。阳性++ 鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈弥漫棕红色。阳性+++ 鳞状表层、中、底层细胞胞浆呈弥漫深棕色。注正常柱状细胞和不完全化生细胞、组织细胞亦可呈阳性着色，尤组织细胞常呈鲜艳的棕红色，它们形态学可以识别，故不计入阳性细胞。 4、结果在120例标本中，按TBS标准，共检出病变细胞23例，不典型鳞状细胞不 明意义(ASC-US)8例，不典型鳞状细胞倾向高度病变(ASC-H)l例，低度病变(LSIL)/HPV6 例，高度病变(HSIL) 1例，单独提示HPV例6例。这些病例中检出酯酶阳性数为22例，阳性 率为95. 65%，阳性强度见表1。
表1 22例宫颈病变细胞酯酶检出结果
结果显示，宫颈鳞状上皮病变细胞大多显示酯酶活性，其阳性强度不等，病变较轻的阳 性强度较低，提示酯酶染色对发现宫颈异常细胞有辅助作用。实施例4检测宫颈液基细胞酯酶活性有助于提高阳性检出率 (一)方法
1、标本
2、连续性220例妇科门诊送检的液基细胞标本，离心、自然沉降制片，每例制成两片 (即一份标本制备同时两张细胞涂片，制片时尽可能把细胞均分)，一片按传统巴氏染色，共 获得巴氏染色涂片220张，设为对照组；另一片按本发明方法作酯酶染色，共获得酯酶染色 涂片220张，设为实验组。2、酯酶染色方法同实例3
3、读片
(1)双盲法读片，实验组由课题组医师观察，诊断采用TBS术语，所不同的是，细胞染色 阳性并有细胞核异常(包括提示HPV)的病例冠以“ANAE+/异常细胞”，细胞染色阴性且无细 胞核异常的登记为阴性；对照组由专职从事宫颈细胞筛查6年资历的细胞助理医师观察。 记录两组读片后的结果。(2) “金标准”确立由3个医师分别认真复查每一张巴氏染色涂片和酯酶染色涂 片，凡诊断结果不一的病例经三人讨论达成一致意见为最后结果，此即“金标准”。(3)统计学以两组第一次诊断结果为参数，对照金标准，进行敏感性、特异性及四 格表X2统计。(二)结果见表2、表3、表4
表2 220例实验组与对照组的筛查结果
※ X2=3. 8673，P=0. 0492，P<0. 05 表3220实验组检出结果与复查后诊断结果(金标准)对照
※ 敏感度为97. 50%，特异性96. 97% ；阳性预测值89. 19% ；阴性预测值99. 22%。 表4220例巴氏组检出结果与复查后诊断结果对照
敏感度为47. 06%，特异性99. 24% ；阳性预测值94. 12% ；阴性预测值87. 92%。
权利要求
一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括试剂A酶固定液，为福尔马林丙酮缓冲液； 试剂B色素基质(1)，为新品红或副品红溶液；试剂C色素基质(2)，为重量比1～10%的亚硝酸钠水溶液；试剂D酶底物，为重量比1～5%的α-醋酸萘酯溶液；试剂E磷酸缓冲液；迈尔苏木素染液。
2.根据权利要求1所述的基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试 剂盒，其特征在于所述试剂盒组成包括10瓶试剂/试剂盒，20个抹片/检测试剂盒试剂A 酶固定液50ml/瓶，1瓶；试剂B:采用IOml的棕色塑料滴瓶内装0. 3ml色素基质(1)，共5瓶；试剂C:色素基质(2)，2ml/瓶，1瓶；试剂D 酶底物，3ml/滴瓶，1瓶；试剂E :pH7. 6磷酸缓冲液，200ml/瓶，1瓶；迈尔苏木素染液50ml/瓶，1瓶。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中的试剂配制如下所述试剂A的酶固定液为福尔马林丙酮缓冲液，pH为6. 6，配制为称取IOOmg的KH2PO4 和20mg的Na2HPO4，先溶解于30ml水中，然后加入45ml丙酮和4% (重量比，下同)甲醛水溶 液25ml，充分混合后，用磷酸溶液调pH至6. 6，置4°C冰箱中保存；所述试剂B的色素基质(1)为新品红或副品红溶液，配制为称取4g新品红或副品红 加入到IOOml浓度为2mol/L的HCl水溶液中，40 60°C水浴直至新品红或副品红溶解，用 滤纸过滤后，置4°C冰箱中保存；所述试剂C的色素基质(2)为重量比为4%的亚硝酸钠水溶液； 所述试剂D的酶底物为重量比为2%的α -醋酸萘酯溶液称取2ga -醋酸萘酯溶于 IOOml丙酮中，置4°C避光保存；所述试剂E的磷酸缓冲液的浓度为l/15mol/L，pH为5. 7 8. 0 称取KH2P049 . 08g溶 于IOOOml蒸馏水中，该液为A液；称取Na2HPO4 · 12H2023. 882g溶于1000ml蒸馏水中，为B 液，以A液13ml与B液87ml混勻即可；所述迈尔苏木素染液将苏木素0. Ig放入蒸馏水IOOml中煮沸溶解，再加入硫酸 铝钾5g和碘酸钠0. 02g,搅拌直至全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0. Ig,继续煮沸 3-lOmin，冷却、过滤，放置16 20小时，即可使用。
4.一种如权利要求1、2或3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于(1)预制染色孵育液取试剂BO. 1 0. 5ml，滴入0. 1 0. 5ml试剂C，轻轻摇晃，3分钟后加入试剂DO. 2 0. 4ml，轻轻摇晃后再加入试剂E8 10ml，即成孵育液；该液体为一次性使用，配置后应在1 小时内用完；剩余液体应废弃，不可留用；(2)染色方法①细胞抹片采用液基细胞的自然沉降法制备宫颈细胞抹片，待细胞最终在沉降孔内自然沉降10分钟后加入试剂A300-800微升，1分钟后l-2min倾去液体；②加入蒸馏水300-1000微升水洗20 50s，倾去液体；将步骤1所述染色孵育液直接滴入孔内，一次滴入6滴，于室温下放置5-15分钟；③倾去染色孵育液，载有细胞的孔内加入300-1000微升蒸馏水，洗2-3遍；④加入迈尔苏木素染液300-1000微升，2-8分钟后倾去迈尔苏木素染液；⑤再在载有细胞的孔内加入试剂E300-1000微升，放置20-60s；⑥梯度酒精脱水，风干后用中性树胶封固；得到染色涂片；于显微镜下观察。
全文摘要
本发明提供了一种基于酸性α-醋酸萘酯酶染色法检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法；所述试剂盒组成包括酶固定液、色素基质(1)、色素基质(2)、酶底物、磷酸缓冲液以及迈尔苏木素染液。该试剂盒用于检测脱落细胞的方法主要通过预制染色孵育液、迈尔苏木素染色、梯度酒精脱水得到染色涂片。该方法利用酸性α-醋酸萘酯酶染色法靶向性检测宫颈脱落细胞中的A萘酚酯酶酶，从而有针对性地显示脱落细胞中增生活跃及潜在异型增生的细胞群。本发明对增生细胞的敏感性较高，核大细胞比常规巴氏染色明显易见，尤其是各种炎性修复反应的鳞状细胞亦可呈阳性，可从形态学上予以区别，达到提高阳性检出率、降低假阴性、提高效率的目的。
文档编号C12Q1/02GK101852697SQ20101018234
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日
发明者谢佐福 申请人:福州泰普生物科学有限公司