专利名称：一种从水稻中克隆出的Osfad8P启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种冷诱导型启动子OsfadSP 核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及将本发明所获基因通过农杆 菌介导的转基因的方法，转入草本植物的单双子叶植物中均可启动下游蛋白表达。
背景技术：
启动子可以与依赖于DNA的RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的一 段DNA序列，是基因表达调控的重要元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核 心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激 活或抑制基因的转录。它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是 启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。诱导型启动子与另外两类相比特点在于它可根据需要在植物特定的 发育阶段、组织器官或特定的生长环境下，诱导基因准确而又选择的起始转录。如有些启动 子上含有光应答元件(LREs)，受光的诱导调节而启动基因转录，当转基因烟草由光照转入 黑暗时，该启动子驱动的GuS活性比在光下低许多(Marraccini P，et al. 2003)。温度效应启动子是受温度诱导活性的启动子，可分为热效应和冷效应启动子两 类。冷效应启动子对低温产生响应，含有保守的CCGAC结构域模体。有些冷效应基因含有G 盒结构(Jiang，et al. 1996)。拟南芥corl5Sa冷效应基因的缺失分析表明，该启动子存在 一个小的近端区域，负责对脱落酸、干旱和冷的环境产生响应(Stokes S. , et al.，1994)， 另外拟南芥rd29A基因在干旱、高盐碱、低温或脱落酸诱导时表达，其启动子-17455区域包 含干旱应答因子(DRE，TACCGACAT) (Narusaka, et al. 2003)。De BruxellesGL 等人对拟南 芥的乙醇脱氢酶基因启动子的研究发现冷胁迫诱导需要一个对无氧条件产生响应的调控 元件共同作用(DE Bruxelles GL, et al. 1996)。Kim HJ等人也报道了在拟南芥中光感应 元件对冷诱导下启动的基因表达是很重要的(Kim，et al. 2002) 0
发明内容
本发明的目的在首先在于提出一种新的水稻中的冷诱导型启动子。本发明的第二目的是提供这种OsfadS的启动子的制备方法。本发明的第三目的是提供这种OsfadS的启动子的应用。本发明提供了一种新的水稻中的冷诱导型启动子，即水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱 氢酶蛋白基因上游的启动子。本发明的一个实施例中，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。在本发明 中简称为0sfad8P。上述启动子编码区的顺式作用元件，包括20个光感应元件，2个干旱响应元件，1 个冷感应元件，和5个对无氧条件产生响应的调控元。
本发明的水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶蛋白基因上游的启动子的编码序列，还 包括具备启动下游基因表达作用的、序列与SEQ ID NO. 1同源度80%及以上的核苷酸序列。本发明的全长启动子在正常的培养温度的条件下不启动下游基因的表达，但是在 低温度(4°C -15°C )处理下，⑶S活性有所提高。本发明提供了用于调取此启动子缺失片段的核苷酸引物，具体引物序列信息参见 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，此启动子的缺失片段的长度为581bp。本发明启动子缺失片段的在正常的培养温度的条件下不启动下游基因的表达，但 是在低温(4°C)处理下，启动下游基因的表达，即GUS活性的提高。但是较全长启动子对低 温的灵敏度低，响应较慢。本发明还提供了一种上述启动子的制备方法，该方法依次包括以下步骤(1)选取生长期的日本晴植株，提取RNA，逆转录成cDNA ；(2)以(1)获得的cDNA为模板，PCR扩增即得。上述启动子制备方法中的提取RNA，逆转录成cDNA和PCR均可以本领域常规的技 术手段和方法。本发明的上述启动子制备方法中，PCR的退火温度为53-58°C。在本发明的一个实 施例中，PCR的退火温度为55°C。上述PCR中，引物根据启动子OsfadSP保守区域设计，使用此对引物对水稻样品 cDNA进行PCR扩增可获得长1862bp，如序列表中SEQ ID NOl所示。SEQ ID N07是SEQ ID NOl互补的序列，SEQ ID N07所示的是3 ‘到5，的顺序。SEQ ID NOl和SEQ ID N07是长 度为1862bp的启动子的正、负两条链，由于它的一些调控元件在正负两条链中都有分布， 所以本发明给出了两条链的DNA片段。引物可采用如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的 序列。PCR，全称为聚合酶链反应，由Muller在1983 1985年间发明，原理是利用引物、 脱氧核糖核酸聚合酶和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸单体在以目标基因为扩增模板的脱氧 核糖核酸双链上，通过变性、退火和延伸的反复循环，将微量原始模板以几何级数方式扩增 至IO6 IO9倍以上，从而能被电泳等方法检测出来。这种检测方法的技术关键在于引物设 计。理想的引物具有专一性识别能力，它们能够从人类数万种基因的复杂背景中，挑选出自 己的目标序列，即脱氧核糖核酸模板，进行特异扩增。通常，在PCR中，采用引物为一对含有 15 25个碱基对的寡聚核苷酸单链，它们可分别与目标基因两端分属于正义链和反义链 的5’端脱氧核糖核酸序列互补结合，起到引导脱氧核糖核酸聚合酶进行延伸的作用。理论 上，PCR扩增产物将按2n的指数曲线增长。于是当进行30 40轮反应循环后，原来一条模 板就会倍增至23° 4°条脱氧核糖核酸双链，后者与原始模板序列完全一致，相当于忠实扩增 了 IO9 IO12倍左右。但受脱氧核糖核酸聚合酶延伸能力和扩增效率的限制，扩增产物长 度一般在1000 2000碱基对之间，增加倍数一般在IO6 IO9倍之间。本发明还提供了含有上述启动子的核苷酸编码序列的重组载体，通过将水稻叶绿 体ω-3脂肪酸脱氢酶蛋白基因上游的启动子插入载体的多克隆位点而得。上述载体可以是扩增载体或者表达载体。例如，将水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶 蛋白基因上游的启动子的核苷酸编码序列插入PCAMBYA1300(市售，也可采用其它带有报 告基因的单双子叶植物的表达载体)载体的多克隆位点所得的表达载体。
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图1.为PCAMBYA1300载体的简图多克隆位点(MCS)含有HindIII和KpnI以及 EcoRI 禾口 SacI0图2.在载体的HindIII和KpnI酶切位点之间插入⑶S报告基因(带有相同酶切 位点的粘性末端的GUS基因)。图3.基于图2载体基础之上，在多克隆位点(MCS)处的EcoRI和SacI位点之间 插入OsfadSP (启动子的全长以及缺失片段，都是用此方法)。具体为采用植物RNAout试剂盒(市售)提取水稻日本晴{水稻京系(Oryza sativa L. cv Eyl 105. Japonica)}正常温度培养的水稻嫩叶 RNA 并采用 PrimeScriptTM RT Reagent Kit (市售)合成cDNA第一链(分别以OsfadSP启动子区5，、3，端序列设计引物 见(SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 4) :5，端引物带EcoRI酶切位点，3，端引物带SacI酶切位 点，以cDNA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物，此产物为带有粘性末端的OsfadSP (带有 相同酶切位点的粘性末端的⑶S基因的获得也参考次部分)并连接到载体PCAMBYA1300构 建PCAMBYA1300-植物表达载体。本发明还提供了上述水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶蛋白基因上游的启动子的应 用，即将含有该启动子的核苷酸编码序列的重组表达载体转入单子叶植物水稻愈伤组织， 以启动下游的基因表达。也可以将该启动子的核苷酸编码序列的重组表达载体转入双子叶 植物拟南芥，以启动下游的基因表达。本发明另外提供了一种检测转基因水稻愈伤组织中OsfadSP启动子启动下游基 因表达的表达模式的方法将OsfadSP启动子的重组表达载体转入水稻愈伤组织，诱导培 养，筛选后恢复培养，取愈伤组织抽提DNA进行PCR，分子鉴定后的愈伤组织进行⑶S检测。 本发明的启动子在低温度(4°C -15°C )处理下，⑶S活性有所提高。该方法具体步骤如下(1)将OsfadSP启动子的重组表达载体转入农杆菌EHA105中，并将含表达载体的 农杆菌菌液与水稻愈伤组织混合培养Ih ；倒掉菌液，待愈伤组织晾干至表面看不到水痕， 将其转移到水稻诱导培养基上，在32°C条件下暗培养。(2) 2d后将暗培养的水稻愈伤组织转移到水稻含潮霉素筛选(25% )培养基上培养。(3)3周后看到转基因阳性植株在培养基上生长状态良好，没有褐化愈伤组织呈现 乳白的小颗粒，聚集成一块大的愈伤组织。(4) PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为培养基中的愈伤组织基因组DNA。(5)分子鉴定后，把鉴定为阳性的愈伤组织分别放到4°C，10°C，15°C，冷处理Id和 2d，然后将愈伤组织浸泡于⑶S染色液(0. Imol C1磷酸钠缓冲液，pH 7. O ；500mg X-Gluc ； 2% DMF ；0. 2%吐温20)中，37°C温育过夜，然后用95%乙醇，37°C脱色2h，到对照材料显现 白色为止，显微镜下观察⑶S表达部位(蓝色即为⑶S表达部位)，并通过照相记录染色结 果并保存。本发明的启动子在正常的培养温度的条件下不启动下游基因的表达，但是在低温 度(4°C -15°C )处理下，⑶S活性有所提高。本发明还提供了一种检测转基因的双子叶植物拟南芥Tl代幼苗中启动子 OsfadSP启动下游基因表达的方法。具体步骤如下
(1)将0sfad8P启动子的重组表达载体转入共转化农杆菌EHA105。(2)于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10 μ 1 IOml接种。28°C,3000rpm 摇过夜，约30h，次日下午6点将已摇活的菌按(1 400)及750 μ 1菌液转至汉300ml YEP+Kan 50+Rif中培养28°C，300rpm约14h，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白 对照，当菌液达到0D600为1. 5 3. 0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶(灭菌)，4°C， 4000g离心lOmin。用10%蔗糖(含0. 02% silwet)稀释至0D600约为0. 8 1. O左右， 用10%蔗糖作对照。转化时将花苞在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。转化前一天将 需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水至透。(3)将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养2d后，将植株立起正 常培养，每3d浇水1次。(4)待转化拟南芥接种后，收获烘干(50°C 2h)。春化后，用乙醇消毒后并撒于抗生 素潮霉素筛选培养基上，两周后获得转化植株的Tl代幼苗。(5) PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为转基因和野生型的拟南芥基因组DNA。(6)鉴定后的植株GUS显色(方法同前所述)本发明中，术语“生长状态良好的愈伤组织”是指筛选培养基上水稻(Kasalath) 的愈伤组织长势很好，组织块较硬，外观呈现乳白，偏白；晶莹剔透，并且没有看到组织表面 有褐化痕迹，组织也没发生枯萎状的表型，没有发黄的表象。本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如是市售的载体以及质粒。Kasalath为中国科学院遗传与发育研究所馈赠的一种籼稻。本发明中所述GUS基因就是转β-葡糖醛酸酶基因.该基因产物为GUS蛋白质， 相当稳定而不易降解，并为一水解酵素，gus基因存在于Ε. coli等一些细菌基因组内，编码 β-葡萄糖苷酸酶。β _葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物， 其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活 性，因此这个基因被广泛应用于基因调控的研究中。根据GUS基因检测所用的底物不同， 可以选择三种检测方法组织化学法、分光光度法和荧光法(灵感度为分光光度检测法最 高)，其中最为常用的是组织化学法(本发明所用方法)。组织化学法检测是以5-溴-4-氯-3-吲哚-β -葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)作为反 应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞存在GUS基因的转化，并表达出 ⑶S蛋白，在适宜的条件下(37 °C )，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产 物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或 在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性。因此利用该方法可 观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果 表明产生的转基因水稻愈伤组织和拟南芥幼苗在10°c和15°C以低温处理下均诱导下游基 因⑶S的表达，并且表达活性随着温度的降低而加强；4°C低温处理Id和2d，随着处理时间 的延长⑶S的活性也增加。本发明分离的水稻启动子OsfadSP，是诱导型启动子。并对其DNA序列上的顺式 作用元件进行了分析，同时还进行了部分转基因的工作，在转基因植物中的表达模式的确 定，证明了此启动子可启动GUS基因在特定的温度下表达的应用。本发明为水稻启动子OsfadSP作为一种有效的温度感应的生物传感器系统提供了一定的理论依据，并对水稻物 种中冷诱导型的启动子的开发与研究做了补充。另一方面，通过转基因技术，为水稻的分子 育种-改造水稻抗性方面提出了新思路，得以精确调控而提高其产量，具有一定的经济价 值。本发明的启动子可应用于具有转化细胞中低温诱导表达，包含其在特定的条件下启动 下游基因的表达以及表达量随温度改变而改变的方法，以及利用分子生物学方法分析该启 动子不同长度片段控制下的报告基因GUS的表达模式。本发明提供了一种新的水稻中的冷诱导型启动子，即水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱 氢酶蛋白基因上游的启动子。将该启动子导入植物在低温度(4°C-15°C)处理下，能够促 进下游基因的表达，在常温下对植物的基因表达没有影响。本发明的启动子可应用于低温 诱导表达，包含其在特定的条件下启动下游基因的表达以及目的基因表达量随温度改变而 改变，为水稻的分子育种-改造水稻抗性方面提出了新思路，可以通过温度的精确调控而 提高其产量。
图1-图3为含目的基因启动子OsfadSP表达载体的构建，构建顺序如图1_图3 所示。图1为表达载体PCAMBYA1300 (_市售)。图2为在其多克隆位点插入⑶S基因(酶切位点为KpnI/Hind III)。图3为在图2的基础上连接水稻启动子0sfad8P。图4为转水稻启动子OsfadSP的转基因水稻愈伤组织和拟南芥植株苗基因组DNA 的提取，电泳检测图。其中，Os+ 水稻转基因阳性愈伤组织；Os-未转基因阴性水稻愈伤组 织DNA ；At+ 拟南芥转基因阳性植株苗的基因组DNA ；At-未转基因的拟南芥阴性苗基因 组 DNA。图5转基因水稻愈伤组织潮霉素基因(HYG)的PCR鉴定，用潮霉素基因的一对特 异引物PCR鉴定样品中潮霉素的表达(780bp)。其中，M为DL2000Marker从上至下2000bp， IOOObp, 750bp,500bp ；+ 水稻转基因阳性愈伤组织的潮霉素基因鉴定；-未转化启动子序 列水稻阴性愈伤组织潮霉素基因鉴定。图6 为转启动子OsfadSP基因的全长1. 862kbp后的⑶S显色。按照管子的标识 依次为_ 未转基因的水稻愈伤组织在冷处理，可看到水稻愈伤组织GUS显色后没有变蓝， 无⑶S活性；4°C Id 转全长启动子OsfadSP基因的水稻阳性愈伤组织4°C冷处理Id后，看 到组织块呈现蓝色，具有GUS活性，说明全长启动子在冷胁迫条件下启动下游GUS基因的表 达；4°C 2d 水稻阳性愈伤组织4°C冷处理2D后，愈伤组织块呈现蓝色，具有⑶S活性，说明 全长启动子在冷胁迫条件下随着胁迫时间的延长，仍旧启动下游基因的表达10°C Id 水稻 阳性愈伤组织10°C冷处理Id后，观察到组织块呈现较深的蓝色，具有GUS活性，说明全长启 动子在适当的冷胁迫条件下(10°C )，启动下游基因的强表达。图7 为转启动子0sfad8P的全长序列1. 862kbp后的⑶S显色后组织块的观察。 A 水稻阳性愈伤组织15°C冷处理Id后，⑶S显色可观察到组织块表面呈现浅蓝色，具有 GUS活性，说明全长启动子在适当的冷胁迫条件下(15°C )启动下游基因的弱表达；B 水稻 阳性愈伤组织10°C冷处理Id后，⑶S显色可观察到组织块表面呈现蓝色，具有⑶S活性，说明全长启动子在冷胁迫条件下(10°C )启动下游基因的表达；C 水稻阳性愈伤组织4°C冷 处理Id后，⑶S显色可观察到组织块表面呈现浅蓝色，但是较15°C冷处理Id后蓝色深，具 有稍高的GUS活性，说明全长启动子在适当的冷胁迫条件下(10°C)启动下游基因的表达； D 水稻阳性愈伤组织4°C冷处理2d后，⑶S显色可观察到组织块表面以及内部呈现蓝色，具 有较强的GUS活性，说明全长启动子在冷胁迫条件下(4°C )启动下游基因的强表达；E 水 稻阳性愈伤组织正常生长温度下(32°C)的组织块，GUS显色可观察到组织块表面以及内部 均未呈现蓝色，无GUS活性，说明在正常的培养温度下全长启动子不启动下游基因的表达 F为转启动子OsfadSP基因的缺失片段长度为581bp后4°C冷处理Id的组织块⑶S活性， ⑶S显色可观察到组织块表面以及内部呈现蓝色，具有较强的⑶S活性，说明启动子缺失片 段在冷胁迫条件下(4°C )启动下游基因的强表达；G 水稻阳性愈伤组织正常生长温度下 (320C )的组织块，⑶S显色可观察到组织块表面以及内部均未呈现蓝色，无⑶S活性，说明 在正常的培养温度下启动子缺失片段不启动下游基因的表达；可看到启动子0sfad8P在低温下被诱导启动基因的转录，并随着温度的降低，⑶S 的活性有所增加；另外581bp的缺失片段也能在低温下启动下游基因，说明这段片段所具 有的冷诱导启动的感应元件已经可以对低温做出响应。图8 为转基因拟南芥植株潮霉素基因(HYG)的PCR鉴定，用潮霉素基因的一对特 异引物PCR鉴定样品中潮霉素基因(780bp)。M为DL2000Marker从上至下2000bp，IOOObp， 750bp，500bp，250bp ；+ 拟南芥转基因阳性苗的潮霉素基因的鉴定；-未转化启动子序列 的拟南芥阴性苗潮霉素基因的鉴定。图9为转基因拟南芥植株苗冷处理下进行⑶S显色鉴定。其中，H、I、J 为生长 25d拟南芥苗；K、L、M和N 为生长18d的拟南芥苗。其中H、J、K、L、M 为转基因阳性植株 苗的冷处理(4°C Id)的⑶S显色；I 未转基因的拟南芥阴性在冷处理4°C Id的GUS显色； N 转基因阳性苗正常生长温度(22°C )下的⑶S显色。可看到启动子OsfadSP在低温下在双子叶植物中被诱导，并且启动下游基因的转录。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进 行。如 Sambrook等分子克隆实验手册(New York Co Id Spring Harbor Labortary Press， 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。实施例1水稻启动子0sfad8P基因的克隆1水稻(Oryza sativa)品种日本晴(Japonica)来自本实验室；生长条件为光周 期 16h/8h(L/D)，27°C。2RNA提取。取IOOmg左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加Iml TriBlue试剂，用力 摇15s，室温放置5min。加0. 2ml氯仿，去蛋白，12k rpm离心IOmin后上清转移至新的离心 管，加等体积异丙醇，充分混勻，室温放置lOmin，12k rpm离心lOmin，弃上清，用DEPC处理 过的水配制的75%乙醇Iml洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5 lOmin，溶于20 μ 1 DEPC 水中，测OD值，电泳检测。
3启动子的克隆。以逆转录的水稻cDNA第一链为模板，利用正向引物 0sFAD8P-F (SEQ ID NO. 2)和反向引物 0sFAD8P-R (SEQ ID NO. 3)克隆全长 0sfad8P, 1. 862kbp ；以及正向引物 0sFAD8P-S-F(SEQ ID NO. 4)和和反向引物 0sFAD8P_S_R(SEQ ID NO. 5)克隆启动子的缺失片段长度为581bp，分别进行PCR，获得启动子全长获得缺失片段 581bp，具体序列信息参见SEQ IDN0. 6。实施例2水稻启动子OsfadSP核苷酸编码区的顺式作用元件分析登陆PLACE数据库在线进行预测OsfadS的启动子DNA序列上的顺式作用元件，分 析其区域上的与冷感应和光信号与拟南芥、欧芹、番茄等生物中的光感应元件相似的有关 顺式作用元件，信息参见发明内容，具体序列如SEQID NO. 1不同标注。实施例3转化水稻启动子OsfadSP的水稻愈伤组织以及拟南芥植株的基因组提取 鉴定以SDS方法小量抽提分别提取转基因水稻愈伤组织和拟南芥苗期的基因组DNA， 产物以1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳检测图见图4。实施例4转化水稻启动子0sfad8P的水稻愈伤组织潮霉素基因(HYG)的PCR鉴定根据载体上潮霉素抗性基因序列设计引物，样品为实施例3中的不同处理水稻愈 伤组织样品的基因组DNA，进行PCR检测，检测结果如图6所示。PCR结果都表明携带启动 子基因的载体质粒已经插入到水稻基因组中。实施例5转化水稻启动子OsfadSP的单子叶植物-水稻的愈伤组织进行⑶S显色
鉴定根据以水稻启动子OsfadSP序列1862bp以及缺失片段581bp，设计扩增出完整 编码阅读框的引物，并在正反向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而 定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，在5’端和3’端分别加入 EcoRI和SacI酶切位点。经EcoRI和SacI双酶切的PCR产物与经过同样双酶切的改造过 的PCAMBIA1300植物表达载体连接(图1-3所示)，转化，测序，确保开放读框正确。将其转 入农杆菌中。正常培养(生长条件为光周期16h/8h(L/D)，32°C)的水稻愈伤组织利用农杆 菌侵染法转化水稻愈伤组织，3周后GUS显色(图4-5)(方法见发明内容)。启动子启动报 告基因⑶S的表达活性，结果表明产生的转基因水稻愈伤组织在低温15°C、10°C和4°C处理 Id均可以被诱导启动⑶S的表达，并且随着温度的降低，⑶S的活性加强。4°C低温处理分 别进行Id和2d，随着处理时间的延长⑶S的活性也增加。缺失片段581bp的启动子在4°C 处理下ld，也诱导⑶S的表达，具有低温诱导型启动子的活性。实施例6转化水稻启动子OsfadSP的拟南芥植株潮霉素基因(HYG)的PCR鉴定以SDS方法小量抽提部分转基因植株的基因组DNA，电泳检测见图4。根据载体上 潮霉素抗性基因序列设计引物，进行PCR检测，样品为不同处理下的拟南芥幼苗。检测结果 如图5所示。PCR结果都表明携带启动子基因的载体质粒已经插入到拟南芥基因组中。实施例7转化水稻启动子OsfadSP基因的双子叶植物-拟南芥幼苗进行⑶S显色 鉴定如实例5所述，将含有OsFADSP启动子序列的农杆菌，对正常培养(生长条件为光 周期16h/8h(L/D)，22°C)的拟南芥进行转基因，采用浸花法转化适当花期的拟南芥。正常 培养，收取种子，获得Tl代幼苗后GUS显色(图9)(方法见发明内容)。
通过与未转基因的对照组相比，可看到转基因阳性植株在4°C低温处理Id后⑶S 活性显色结果显示，其根部以及莲座叶基部有较明显的GUS活性(图9)，即OsFADSP启动 ⑶S在这两个特定部位起始转录。并且观察结果显示，转此基因的植株与野生型营养生长没 有区别，生长良好。
权利要求
水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶蛋白基因上游的启动子。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDN0. 1。
3.—种如权利要求1所述的启动子的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤(1)选取生长期的日本晴植株，提取RNA，逆转录成cDNA;(2)以(1)获得的cDNA为模板，PCR扩增即得。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR的退火温度为55°C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR的引物序列如SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
6.含有权利要求1所述的启动子的核苷酸编码序列的重组载体。
7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，该重组载体是将权利要求1所述的启动 子的核苷酸编码序列插入PCAMBYA1300载体的多克隆位点所得。
8.权利要求1所述启动子的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述启动子的核苷酸 编码序列的重组表达载体转入单子叶植物水稻愈伤组织，以启动下游的基因表达。
9.权利要求1所述启动子的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述启动子的核苷酸 编码序列的重组表达载体转入双子叶植物拟南芥，以启动下游的基因表达。
全文摘要
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，本发明提供了一种新的水稻中的冷诱导型启动子，即水稻叶绿体ω-3脂肪酸脱氢酶蛋白基因上游的启动子。将该启动子导入植物在低温度(4℃-15℃)处理下，能够促进下游基因的表达，在常温下对植物的基因表达没有影响。本发明的启动子可应用于低温诱导表达，包含其在特定的条件下启动下游基因的表达以及目的基因表达量随温度改变而改变，为水稻的分子育种-改造水稻抗性方面提出了新思路，可以通过温度的精确调控而提高其产量。
文档编号C12N15/63GK101886073SQ201010182410
公开日2010年11月17日 申请日期2010年5月12日 优先权日2009年5月14日
发明者张 浩, 明凤, 曹英萍, 李敏, 石金磊 申请人:复旦大学