一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒及其使用方法

专利名称：：一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒及其使用方法
技术领域：
：本发明涉及一种显示细胞增殖活性的试剂盒及其使用方法，具体地涉及一种显示脱落细胞如宫颈脱落细胞、食管刷片细胞等抹片上细胞酸性磷酸酶的方法及试剂盒。
背景技术：
：从上世纪中叶开始，巴氏抹片和染色技术被逐步推广成为一种子宫颈癌的筛选方法。在获得推广的国家中可以发现，应用这种方法后大大减少了子宫颈癌的死亡率和发病率。在美国每年有超过5000万例行抹片筛查，其中有350万(7%)检出有阳性/异常。然而，每年仍然有4500人死亡和13000例新的子宫颈癌病例1。研究表明，20%的新癌症病例在美国用巴氏染色从未检出过阳性，在疾病发作前有3到5年时间巴氏染色结果为阴性。尽管巴氏染色法是最成功、最有效的癌症筛查法，但是它的缺陷导致了很高的假阴性率。尽管最近对巴氏技术进行了一定的改善，如引进液基细胞自动化涂片技术，人乳头状瘤病毒检测，以及更多的如免疫细胞化学方法，但此问题仍然存在。是否有替代巴氏染色法的技术呢？在1959年至1980年，一些在医学文献中提到了在子宫颈癌细胞内有醋氯酸酯酶、B-葡萄糖醛酸酶、酸性磷酸酶的活性，并且用了患有宫颈癌和子宫癌妇女的阴道分泌物及冰冻切片组织化学来证明。不幸的是，此结果后来没有任何进展，直到1997年Markovics提出一个想法，在检测宫颈不典型增生的子宫颈抹片检查中这些酶是否可以发挥更加重要的作用，亦即能否减少假阴性的判读率。1998年，Markovics发表了关于宫颈脱落上皮酸性磷酸酶检测的结果和进展，并研究出了一个新的CAP-PAP染色法。该方法能将巴氏染色结果中的异常子宫颈细胞内的酸性磷酸酶明显着色，可作为天然的子宫颈鳞状细胞异型增生的生物标记物。2003年，Markovic发表了1000例宫颈细胞染色的结果，测试了CAP-PAP的灵敏度为81%，特异性为97%，与传统巴氏染色相比较显著地提高了阳性检出率(p<0.05)。由此得出结论是CAP染色的能增加巴氏染色的敏感性，使细胞检验员筛查标本时能显著提高检阳性/异常标本检出率禾口减少假阴性率(Markovic0，MarkovicN，etal.Cervicalacidphosphatase:Anewbiomarkerofcervicaldysplasia.ArchOncol2003;11:243-247)然而，该操作方法在应用上有以下几个不足之处1、酶孵育液配制过程繁杂，表现在(1)偶氮盐要临时用亚硝酸钠配制，需要在含有的46ml和2.5ml醋酸的烧瓶内预温反应3分钟，既费时又费力。(2)、每次配制各种试剂需要加入10滴试剂，这样在实际使用时容易发生错误。2、孵育时间较长，需要45分钟。3、需巴氏染色复染，增加了操作步骤且影响到酶反应产物的观察。4、染色全程时间过长，全程需要60分钟以上。5、应用范围窄，仅用于宫颈细胞。5、试剂盒材料及包装成本较高。
发明内容本发明的目的在于提供一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色方法，本发明的方法改良了CAP-PAP染色法的配方和操作技术，使之能更方便和廉价地运用于液基细胞沉降法制片染色中。本发明提供的技术方案如下本发明提供的一种显示细胞增殖活性的试剂盒，包括两种类型，其中试剂盒I，包括(1)、试剂A-酶底物l，含固酱紫0.25-1%;(2)、试剂B-酶底物2含AS-TR磷酸酯0.5_2%;(3)、试剂C:0.050.20M醋酸缓冲液，PH5.05.5(4)、试剂D-酶固定液含柠檬酸0.5g1.0g，蒸馏水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.Oml，氯化镁O.05-0.lg;(5)、磷酸盐缓冲液:0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(6)、Mayer苏木素。试剂盒II，包括(1)、试剂A-酶试纸试纸含有酸性磷酸酶底物AS-TR磷酸酯和显色剂固酱紫成分；(2)、试剂B-醋酸盐缓冲液；含1050%PVP的0.050.20mol/L、醋酸盐溶液，PH5.05.5;(3)、试剂C-酶固定液含柠檬酸0.51.0g，蒸馏水25.035.Oml，甲醇5.015.Oml，丙酮50.070.Oml，氯化镁O.05-0.lg;(4)、试剂D-缓冲液;0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(5)、Mayer苏木素。试剂盒的制作方法I型(1)、试剂A-酶底物1:固酱紫GBC按O.25_1%重量体积比溶解于10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，暗处冰浴下进行。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶2ml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。(2)、试剂B-酶底物2:AS-TR磷酸酯按0.5_2%重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶lml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。(3)、试剂C:0.050.2MPH5.05.5醋酸缓冲液:甲液含3H20的醋酸钠24g，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸l.2ml，蒸馏水加至200.Oml;以乙液滴定甲液至1^=5.05.5。，用6ml滴瓶分装。(4)、试剂D-酶固定液，含柠檬酸0.5gl.Og，蒸馏水2535.Oml，甲醇515.0ml，丙酮5070.Oml，氯化镁O.05-0.lg，以100.Og/L氢氧化钠调整PH=5.05.5;用50ml滴瓶分装。(5)、磷酸盐缓冲液:经典方法配制，O.0050.02M，PH8.0PH8.5;用200ml塑料瓶分装。(6)、Mayer苏木素将苏木柴0.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜。用50ml滴瓶分装。II型酶试纸(试剂A)制作固酱紫GBC按2_4%重量体积比溶解于10%50%聚乙烯吡咯烷酮中；AS-BI磷酸酯按2_4%重量体积比溶解于二甲基甲酰胺；中速定性滤纸切成所需形状，然后用含0.3%EDTA二钠的1%甲基纤维素浸润湿透后晾干；取GBC和AS-BI各25微升滴于滤纸两端，晾干，或放置于冷冻干燥机中干燥；之后真空包装。0.050.2匪PH5.05.5醋酸缓冲液:甲液含3H20的醋酸钠24g，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.Oml;以乙液滴定甲液至PH二5.05.5，再按体积比加入1050%PVP。用6ml滴瓶分装。其余组分的配制方法与I型类似。—种显示细胞增殖活性的方法，包括以下步骤取试剂盒I中试剂Al滴、试剂Bl滴滴入到试剂C滴瓶中即成孵育液，轻轻摇晃备用，或取试剂盒II中的试剂A试纸条一条放入到试剂B滴瓶中，放置10分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液。(1)、细胞抹片按沉降法制片，细胞沉降后加入固定液500微升，一分钟后倾去液体。(2)、加入蒸馏水500微升水洗2535秒，倾去液体。(3)、将染色孵育液直接滴入载有细胞的玻片孔内，一次滴入58滴。然后将染色板放入37°C的水浴箱内，30分钟。(4)、倾去染色液，加入500微升缓冲液，2535秒，洗2遍。(5)、加入苏木素染液500微升，2-6分钟后倾去染液。(6)、加入缓冲液500微升2535秒，2遍。(7)、自然风吹干，阿拉伯树胶封固；或快速通过95%、100%酒精脱水风干后用中性树胶封固。本发明试剂盒可检测的细胞为脱落细胞，包括宫颈脱落细胞、食管刷片细胞等脱落细胞。染色结果1、HPV感染细胞、低度病变、高度病变、癌细胞呈数量不等的红色颗粒沉着，成熟正常鳞状细胞(中、表层细胞)阴性。2、宫颈柱状细胞、化生细胞、部分底层细胞、组织细胞呈红色颗粒沉着。这些细胞可作为染色成功的质控标准。3、在萎縮性反应中，多数底层细胞和化生细胞呈阴性。白色念珠菌呈鲜艳的红色。本发明与传统巴氏抹片法相比，具有更好的精确度，即更高的敏感性和相同的特异性。与CAP-PAP法相比，区别如下CAP-PAP法在宫颈直接抹片和间接抹片(液基)，显示不典型增生细胞中的酸性磷酸酶供显微镜观察，其用途在于1、研究这些标记的生物学意义，2、供临床应用，对照显示了这种方法在宫颈普查中比传统巴氏染色有更好的精确度。而本发明在脱落细胞标本中(直接抹片和液基制片中)显示增生活跃的细胞含有丰富的酸性磷酸酶，其用途在于1、指引显微镜观察者把注意力集中在这些增生活跃的细胞上，并从中甄别"有问题"的细胞(如不典型增生的细胞)；2、供食宫颈癌筛查和食管刷片作食管癌筛查，也可作为其它细胞制片研究和帮助发现异常细胞。此外，本发明与CAP-PAP法相比，其创造性在于(1)配方和酸性磷酸酶标准染色相比在于调整了配方、HI值，使之可更清晰地显示各种脱落细胞的酸性磷酸酶颗粒。(2)试剂型式浓縮的酶底物及试纸型式节省了偶氮过程时间，使试剂临时配制更为简单和方便操作。(3)试剂C:含有PVP的醋酸缓冲液避免了染色前对试剂的过滤，从而节省了时间，避免了染料颗粒非特异性沉着。(4)酶固定液(试剂D):含有可恢复酶活力的微量激动剂(氯化镁O.05_0.1%)，使之可用于在不良条件固定的细胞得以恢复酸性磷酸酶活性，达到理想的显示效果。(5)改进了细胞片制备方法，本发明的沉降法，与传统抹片方法相比，减少了细胞层厚度，可改进染色效果和读片效果。本项发明和美国CAP-PAP的比较见表1表1本项发明和美国CAP-PAP的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>图1为本发明实施例1染色结果图之一，示CAP阳性颗粒大小分布不等，靠近核膜(40X)。图2为本发明实施例1染色结果图之二，示CAP阳性颗粒沿核膜排列(40X)。图3为本发明实施例1染色结果图之三，示一群柱状细胞，阳性颗粒大小和分布均匀(10X)。图4为本发明实施例1染色结果图之四，示高度病变细胞，显示粗大颗粒，且分布不均匀(100X)。图5为本发明实施例1染色结果图之五，示组织细胞，显示鲜艳均匀分布的红色颗粒(40X)。具体实施例方式—、试剂柠檬酸醋酸醋酸钠氯化镁甲醇二甲基甲酰胺AR聚乙烯吡咯烷酮(PVP)4K偶氮固酱紫(fastgarnetGBCsalt)美国sigma萘酚AS-TR磷酸酯(n即htholeAS-TRphosphate)德国产磷酸缓冲液0.01M2，购买或自配。迈尔(Mayer)苏木素液二、设备与器械2.1设备真空包装机(包装茶叶机即可)、实验室冷冻干燥机FD-1C(陕西太康科教仪器有限公司)、干燥箱、水浴箱、普通冰箱、磁力搅拌器、电子天平(毫克级，精确到小数点4位)、定量移液瓶。2.2器械移液枪(10微升-100微升)、移液枪(10-1000微升)。试剂级塑料滴瓶2ml、5ml、15ml、50ml。试剂瓶50ml、100ml、300ml。搪瓷盘等。三、试剂配制细胞增殖活性耙向细胞染色试剂盒II型3.l称量GBC固酱紫、AS-TR磷酸酯。应在暗光下进行，采用电子天平，毫克级。根8据批量确定称量。注意称量室湿度应小于70%。3.2溶液配制3.2.150%PVP，用磁力搅拌机搅拌，充分溶解后静置至无气泡为止。3.2.20.lmol/L醋酸缓冲液(试剂B):甲液醋酸钠(含3H20)2.72g，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.2。再按体积比加入50%PVP。分装于6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(试剂C)，柠檬酸O.63g，蒸馏水30.0ml，甲醇IO.Oml，丙酮60.Oml，酶激活剂适量(氯化镁0.07g)，以100.0g/L氢氧化钠调整PH=5.4。分装于50ml滴瓶。3.2.3迈尔苏木素液将苏木素O.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。分装于50ml滴瓶。3.2.4磷酸盐缓冲液0.01M2，按经典配方自配。分装于200ml塑料瓶。3.3酶试纸(试剂A)制作(暗室进行)3.3.1固酱紫GBC按O.5%重量体积比溶解于50%聚乙烯吡咯烷酮中(见3.2.1)，暗处冰浴下进行。AS-TR磷酸酯按2%重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺。3.3.2中速定性滤纸60X60，滤纸用不锈钢裁刀切成1.5厘米X5厘米，然后用含0.3%EDTA二钠的1%甲基纤维素浸润湿透后晾干。3.3.3在红光下取GBC和AS-BI各25微升滴于滤纸两端。3.3.4将滤纸中央部用夹子夹紧放铁线晾干，或放置于冷冻干燥机中干燥。3.3.5真空包装镀铝纸袋3厘米X6厘米，真空包装机包装，每袋一条。3.3.6保存2-8。C试剂盒II型(10test，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶试纸，5条/包，1包2、试剂B:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，6瓶3、试剂C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、试剂D:磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂A试纸条一条放入入到试剂B滴瓶中，放置10分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。细胞增殖活性耙向细胞染色试剂盒(I型)一、试剂盒(5test，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、试剂B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、试剂C:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，5瓶4、试剂D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶其中试剂A(酶底物1):固酱紫GBC按0.5X重量体积比溶解于50X聚乙烯吡咯烷酮中，暗处冰浴下进行。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶2ml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂B(酶底物2):AS-TR磷酸酯按1.0%重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶lml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂C、试剂D、磷酸缓冲液及Mayer苏木素配制方法与II型同，不再详述。I型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂A1滴、试剂B1滴滴入到试剂C滴瓶中即成孵育液，轻轻摇晃备用。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。试剂盒I或试剂盒II在使用时配备说明书及《靶向染色液读片指导》及配图，以指导使用者使用。实施例1:子宫颈癌筛查试验设计1、实验组宫颈脱落细胞涂片材料来自每日门诊妇科病例和体检部零散妇科体检人群。采用福建泰普生物科学有限公司保存液和取样刷按标准在宫颈移行区采样，并按本发明方法进行染色制片(后面将详细介绍)。2、对照组用同一份标本制备另外一张涂片(即一份标本制备同时两张细胞涂片，制片时尽可能把细胞均分)，采用常规巴氏染色。3、读片及登记采用双盲法读片，实验组由课题组医师观察，诊断采用TBS术语，所不同的是，细胞染色阳性并有细胞核异常(包括提示HPV)的病例冠以"0八+/异常细胞"，细胞染色阴性且无细胞核异常的登记为阴性；对照组由专职从事宫颈细胞筛查6年资历的细胞助理医师观察。两组读片后对照结果，凡诊断结果不一的病例重新复查涂片。全部病例经3个以上医师达成一致结果为最后结果。以最后结果为"金标准"，以两组第一次诊断结果为参数，进行各项统计学处理。4、读片时间比较记录两组读片总时间，计算平均时间。实验组的染色方法具体如下取试剂盒I中A液1滴、B液1滴入C液中，轻轻晃动混匀成孵育液备用；或取试剂盒II中试剂A试纸条一条放入入到试剂B滴瓶中，放置10分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液。染色过程为(1)、细胞抹片按沉降法制片，细胞沉降10分钟后加入试剂盒配备的固定液500微升，一分钟后倾去液体；(2)、加入蒸馏水500微升水洗30秒，倾去液体；(3)、将染色孵育液直接滴入载有细胞的玻片孔内，一次滴入6滴，然后将染色板放入37°C的水浴箱内，35分钟；(4)、倾去染色液，加入500微升缓冲液，洗2遍；(5)、加入苏木素染液500微升，4分钟后倾去染液；(6)、加入缓冲液500微升30秒，两次；(7)、自然风吹干，阿拉伯树胶封固；或快速通过95%、100%酒精脱水风干后用中性树胶封固。前述的沉降法制宫颈细胞涂片过程为已采样的细胞保存液瓶，振荡30秒，分别加入4毫升梯度离心液。取标本瓶中的液体8毫升加入上述离心管中，先以1080转/分，离心2分钟。用吸管吸弃上面8毫升液体，再以2000转/分，离心10分钟，取出离心管迅速倒掉上清液。离心管中加入500-800微升缓冲液在振荡器上振荡25秒，使离心管底部聚集的细胞加复悬浮状态。吸取离心管中混匀的细胞悬液300微升移至固定好的染色槽中，槽下为涂有细胞贴附剂的载玻片，静止自然沉淀IO分钟，倾去玻片上多余液体，即制成宫颈细胞薄层涂片。结果166例宫颈涂片试验与对照组筛查结果见表。显微镜下，红色颗粒状阳性细胞一目了然。在实验组37例阳性标本中，多数在大的鳞状细胞(中表层细胞)或外底层细胞的胞浆里见到数量不等的阳性颗粒。这些颗粒的大小和分布没有明显的规律，它们或紧密靠近胞核(图1)，或沿着胞膜排列(图2);红色颗粒大小自0.1-1微米不等；阳性颗粒的密度稀疏不定，有时很微弱，需要仔细辨别；有时反应很强，可掩盖整个细胞。对于良性的柱状细胞和化生细胞，阳性颗粒大小和分布比较均匀一致(图3);而在高度病变的小细胞，阳性颗粒的分布和大小表现得不一致(图4)。组织细胞通常表现鲜红色均匀一致的强阳性反应，很容易和其它细胞区别开来(图5)。实验组发现一例组织细胞数量极多，细胞体积很大，相应地在对照组的巴氏染色中误认为退变的鳞状细胞。如表2所示，实验组阳性检出率为22.29%，对照组为10.24%，实验组显著高于对照组。经3人复查两组，最后统一诊断意见，明确166例中阳性检出病例共34例，阳性检出率为20.48%。实验组除一例未检出阳性外，其余均符合复查的阳性结果。而巴氏组共有9例假阴性，主要类型细胞是HPV感染细胞和不典型细胞。它们或是因为数量少或是因在巴氏染色中胞浆染色过深、挖空细胞表现不明显而漏检。实验组7个"不确定"的病例，在对应巴氏组中亦未检出阳性结果，这些病例暂时定为炎性修复性细胞。这样，统计结果(见表3、表4)显示本发明敏感度(97.06%)显著高于传统巴氏染色(47.06%)，而特异性(96.97%)和巴氏染色(99.24%)相近，巴氏染色假阴性率高达12.08%(18/149)。166片总读片时间实验组323分钟(1.95分/片)，对照组为845分钟(5.09分/片)。筛查每张涂片的时间实验组比对照组减少3分钟。表2:166例实验组与对照组的筛查结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3166实验组检出结果与复查后诊断结果对照<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>敏感度为97.06%，特异性96.97%;阳性预测值89.19%;阴性预测值99.22%。表4166巴氏组检出结果与复查后诊断结果对照<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>令敏感度为47.06%，特异性99.24%;阳性预测值94.12%;阴性预测值87.92%。尽管截至目前为止，宫颈脱落细胞的检查仍旧是依赖细胞的形态学的变化，然而，要在上万个细胞中搜寻为数不多，甚至只有个位数的细胞确非易事。本发明染色液的理念是提供一种导向，即避开大量无关的细胞，节省时间和精力，将细胞医师的注意力导向到增殖活跃的细胞群体上，然后再仔细观察它们的细胞形态表现。本结果显示，靶向染色液能标记子宫颈成熟鳞状细胞中的异常细胞，由于正常成熟鳞状细胞呈阴性反应，因此呈红色颗粒状的阳性细胞在低倍镜下即可容易地观察到，即便是一个细胞或弱阳性反应亦可看到。在常规巴氏染色中，个别存在的不典型鳞状细胞很容易从细胞学者的眼中逃逸，而本发明靶向染色液能清楚地显示那些少量散在甚至是个别存在的不典型鳞状细胞。此外，靶向染色有利于HPV感染细胞的诊断，如本发明所示，实验组提示HPV检出例数显著高于对照组(见表2)，经复查后在常规巴氏染色组均找到散在的挖空细胞，我们分析，巴氏染色可因胞浆的过染影响挖空细胞的观察。虽然良性的柱状细胞和化生细胞可以阳性，但它们的颗粒大小和分布一致，且形态学容易识别。这些细胞的存在反而为判断标本的满意度及试剂本身的质量控制提供了方便。本发明结果显示，本发明靶向染色法能减少筛选时间。这是由于在适应了新的染色后，鲜艳的红色颗粒总是在第一时间吸引了镜检者的注意，并且阳性的细胞数量总是远少于总的细胞量，由于我们不必要关注的细胞少了，就必然减少了筛查所需时间。总之，靶向染色增加了检测异常细胞的灵敏度，与TBS诊断标准相结合又可保持和巴氏染色方法相近的特异性。实施例2回顾性统计资料从厦门市第二医院病理科宫颈细胞学筛查资料电脑系统中调取2009年9月1日-11.26日采用本发明染色液后用TBS诊断术语的诊断结果，并与2008年同时期采用巴氏染色的诊断统计结果进行比较，其结果(见表5)显示，耙向染色对非典型鳞状细胞、非典型腺细胞、上皮内低度病变、上皮内高度病变以及提示HPV检出率(26.8%)显著高于传统的巴氏染色(11.81%)。表52009年耙向染色与2008年巴氏染色同比检出率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3、食管刷取脱落细胞对厦门市第二医院内窥镜室送检的食管刷片细胞抹片39例进行性靶向染色(染色方法同实施例l)，并与常规巴氏染色进行比较，结果(表6.)显示实验组阳性检出率高于巴氏组。表639例食管刷片靶向染色和传统巴氏染色结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例4溶液配制3.2.110%PVP，用磁力搅拌机搅拌，充分溶解后静置至无气泡为止。3.2.20.05mol/L醋酸缓冲液(试剂B):甲液醋酸钠(含3H20)2.OOg，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.0。再按体积比加入10%PVP。分装于6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(试剂C)，柠檬酸0.50g，蒸馏水25.Oml，甲醇5.Oml，丙酮50.Oml，酶激活剂适量(氯化镁0.05g)，以100.Og/L氢氧化钠调整ra=5.0。分装于50ml滴瓶。3.2.3迈尔苏木素液将苏木素O.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。分装于50ml滴瓶。3.2.4磷酸盐缓冲液0.005MO，按经典配方自配。分装于200ml塑料瓶。3.3酶试纸(试剂A)制作(暗室进行)3.3.1固酱紫GBC按0.25X重量体积比溶解于10%聚乙烯吡咯烷酮中(见3.2.l)，暗处冰浴下进行。AS-TR磷酸酯按3X重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺。3.3.2中速定性滤纸60X60，滤纸用不锈钢裁刀切成1.5厘米X5厘米，然后用含0.3%EDTA二钠的1%甲基纤维素浸润湿透后晾干。3.3.3在红光下取GBC和AS-BI各25微升滴于滤纸两端。3.3.4将滤纸中央部用夹子夹紧放铁线晾干，或放置于冷冻干燥机中干燥。3.3.5真空包装镀铝纸袋3厘米X6厘米，真空包装机包装，每袋一条。3.3.6保存2-8。C试剂盒II型(10test，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶试纸，5条/包，1包2、试剂B:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，6瓶3、试剂C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、试剂D:磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂A试纸条一条放入入到试剂B滴瓶中，放置10分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。细胞增殖活性耙向染色试剂盒(I型)一、试剂盒(5test，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、试剂B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、试剂C:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，5瓶4、试剂D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶试剂A(成分及配制方法)固酱紫GBC按0.25X重量体积比溶解于10%聚乙烯吡咯烷酮中，暗处冰浴下进行。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶2ml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂B(成分及配制方法)AS-TR磷酸酯按0.5%重量体积比溶解于二甲基甲酰胺。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶lml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂C、试剂D、磷酸缓冲液及Mayer苏木素配制方法与II型同，不再详述。I型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂Al滴、试剂Bl滴滴入到试剂C滴瓶中即成孵育液，轻轻摇晃备用。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。本实施例试剂盒I和II的使用方法同前述相同。实施例5溶液配制3.2.130%PVP，用磁力搅拌机搅拌，充分溶解后静置至无气泡为止。3.2.20.2mol/L醋酸缓冲液(试剂B):甲液醋酸钠(含3H20)4.OOg，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至1^=5.5。再按体积比加入25%PVP。分装于6ml滴瓶。3.2.3酶固定液(试剂C)，拧檬酸l.0g，蒸馏水35.Oml，甲醇15.0ml，丙酮70.Oml，酶激活剂适量(氯化镁0.10g)，以100.Og/L氢氧化钠调整ra=5.5。分装于50ml滴瓶。3.2.3迈尔苏木素液将苏木素O.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。分装于50ml滴瓶。3.2.4磷酸盐缓冲液0.02M5，按经典配方自配。分装于200ml塑料瓶。3.3.2中速定性滤纸60X60，滤纸用不锈钢裁刀切成1.5厘米X5厘米，然后用含0.3%EDTA二钠的1%甲基纤维素浸润湿透后晾干。3.3.3在红光下取GBC和AS-BI各25微升滴于滤纸两端。3.3.4将滤纸中央部用夹子夹紧放铁线晾干，或放置于冷冻干燥机中干燥。3.3.5真空包装镀铝纸袋3厘米X6厘米，真空包装机包装，每袋一条。3.3.6保存2-8°C试剂盒II型(lOtest，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶试纸，5条/包，1包2、试剂B:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，6瓶3、试剂C:50ml酶固定液/滴瓶，1瓶4、试剂D:磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶5、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶II型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂A试纸条一条放入入到试剂B滴瓶中，放置IO分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。细胞增殖活性耙向染色试剂盒(I型)一、试剂盒(5test，20抹片/test)组成:1、试剂A:酶底物1，2ml/滴瓶，共1瓶2、试剂B:酶底物21ml/滴瓶共1瓶3、试剂C:6ml醋酸盐缓冲液/滴瓶，5瓶4、试剂D:酶固定液50ml/滴瓶，l瓶5、磷酸盐缓冲液200ml(K18.2)，1瓶6、Mayer苏木素50ml/滴瓶，1瓶试剂A(成分及配制方法)固酱紫GBC按1.0%重量体积比溶解于30%聚乙烯吡咯烷酮中，暗处冰浴下进行。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶2ml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂B(成分及配制方法)AS-TR磷酸酯按2.0%重量体积比溶解于二甲基甲酰胺。用2ml黑色塑料滴瓶分装，每瓶lml。拧紧瓶盖，镀铝纸真空包装。试剂C、试剂D、磷酸缓冲液及Mayer苏木素配制方法与II型同，不再详述。I型靶向型染色孵育液配制(染色前准备)取试剂Al滴、试剂Bl滴滴入到试剂C滴瓶中即成孵育液，轻轻摇晃备用。该液体为一次性使用，配置后应在6小时内用完。剩余液体应废弃，不可留用。本实施例试剂盒I和II的使用方法同前述相同。上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。权利要求一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒I，包括(1)、试剂A-酶底物1含固酱紫0.25-1％；(2)、试剂B-酶底物2含AS-TR磷酸酯0.5-2％；(3)、试剂C0.05～0.2M醋酸缓冲液，PH5.0～5.5；(4)、试剂D-酶固定液含柠檬酸0.5g～1.0g，蒸馏水25～35.0ml，甲醇5～15.0ml，丙酮50～70.0ml，氯化镁0.05-0.10g；(5)、磷酸盐缓冲液0.005～0.02M，PH8.0～PH8.5；(6)、Mayer苏木素。2.如权利要求1所述的显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒I，其配制方法为(1)、试剂A酶底物1:固酱紫按O.25-1%重量体积比溶解于10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中，暗处冰浴下进行；(2)、试剂B酶底物2:AS-TR磷酸酯按0.52%重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺；(3)、试剂C:0.050.2MPH5.05.5醋酸缓冲液甲液含3H20的醋酸钠24g，蒸馏水加至200.ml;乙液冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.0ml;以乙液滴定甲液至ffl=5.05.5;(4)、试剂D-酶固定液，拧檬酸O.5g1.0g，蒸馏水2535.Oml，甲醇515.Oml，丙酮5070.Oml，氯化镁0.05-0.10g，以100.Og/L氢氧化钠调整PH=5.05.5;(5)、磷酸盐缓冲液按经典方法配制；(6)、Mayer苏木素将苏木柴O.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜。3.如权利要求1所述的显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒I，其使用方法为染色前配制酶孵育液取试剂Al滴、试剂Bl滴，滴入到试剂C滴瓶中即成孵育液，轻轻摇晃备用；染色过程(1)、细胞抹片按沉降法制片，细胞沉降10分钟后加入试剂D固定液500微升，一分钟后倾去液体；(2)、加入蒸馏水500微升水洗2535秒，倾去液体；(3)、将试剂染色孵育液直接滴入载有细胞的玻片孔内，一次滴入58滴；然后将染色板放入37°C的水浴箱内，3040分钟；(4)、倾去染色液，加入500微升缓冲液，洗2遍；(5)、加入苏木素染液500微升，2535秒后倾去染液；(6)、加入缓冲液500微升2-6分钟，倾去液体，2遍；(7)、自然风吹干，阿拉伯树胶封固；或快速通过95%、100%酒精脱水风干后用中性树胶封固。4.如权利要求3所述的靶向细胞染色试剂盒I的使用方法，其特征在于所述细胞为宫颈脱落细胞、食管刷片细胞。5.—种显示上皮细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒II，包括(1)、试剂A-酶试纸试纸含有酸性磷酸酶底物AS-TR磷酸酯和显色剂固酱紫成分；(2)、试剂B-醋酸盐缓冲液；0.050.2mol/L醋酸盐溶液，含10%50%PVP;(3)、试剂C-酶固定液含柠檬酸0.51.0g，蒸馏水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.Oml，氯化镁O.05-0.lg;(4)、试剂D-缓冲液；磷酸盐缓冲液，0.0050.02M，PH8.0PH8.5;(5)、Mayer苏木素。6.如权利要求5所述的显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒II，其配制方法为(1)、试剂A-酶试纸；固酱紫GBC按2-4%重量体积比溶解于10%50%聚乙烯吡咯烷酮溶液中；AS-TR磷酸酯按2_4%重量体积比溶解于纯二甲基甲酰胺；中速定性滤纸切成所需形状，然后用含0.3%EDTA二钠的1%甲基纤维素浸润湿透后晾干；取GBC和AS-BI各25微升滴于滤纸两端，晾干，或放置于冷冻干燥机中干燥；之后真空包装；(2)、试剂B-醋酸盐缓冲液醋酸钠(含3H20)24g，蒸馏水加至200.ml成甲液；冰醋酸1.2ml，蒸馏水加至200.0ml成乙液；以乙液滴定甲液至ffl=5.05.5;再按体积比加入1050%PVP。(3)、试剂C-酶固定液；柠檬酸O.51.0g，蒸馏水25.035.0ml，甲醇5.015.0ml，丙酮50.070.0ml，氯化镁0.05-0.lg，以100.0g/L氢氧化钠调整PH=5.4;(4)、试剂D-缓冲液；按经典方法配制成0.0050.02M，PH8.0PH8.5磷酸盐缓冲液；(5)、Mayer苏木素将苏木柴O.lg放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.lg，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜。7.如权利要求5所述的一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒II，其使用方法为染色前配制酶孵育液(试剂C):取试剂A试纸条一条放入到试剂B滴瓶中，放置10分钟后轻轻摇晃备用即成孵育液；(1)、细胞抹片按沉降法制片，细胞沉降10分钟后加入试剂D液500微升，一分钟后倾去液体；(2)、加入蒸馏水500微升水洗2535秒，倾去液体；(3)、将试剂C染色孵育液直接滴入载有细胞的玻片孔内，一次滴入58滴，然后将染色板放入3540°C的水浴箱内，3040分钟；(4)、倾去染色液，加入500微升缓冲液，洗2遍；(5)、加入苏木素染液500微升，2-6分钟后倾去染液；(6)、加入缓冲液500微升2535秒，倾去液体，2遍;(7)、自然风吹干，阿拉伯树胶封固；或快速通过95%、100%酒精脱水风干后用中性树胶封固。8.如权利要求7所述的靶向细胞染色试剂盒I1的使用方法，其特征在于所述细胞为宫颈脱落细胞、食管刷片细胞。9.如权利要求1或5所述的靶向细胞染色试剂盒，其特征在于还包括说明书及《耙向染色液读片指导》及配图。全文摘要本发明公开了一种显示细胞增殖活性的靶向细胞染色试剂盒及其使用方法。本发明试剂盒分为I型和II型，分别包括酶底物、试纸、酶固定液、磷酸盐缓冲液、Mayer苏木素等。染色方法是制片、固定、染色等。本发明方法可显示脱落细胞如宫颈脱落细胞、食管刷片细胞等抹片上细胞内酸性磷酸酶，并以此靶向寻找异常增生细胞。该方法与传统巴氏抹片法相比，检测癌和癌前病变的灵敏度更高，特异性相近，因而本发明可作为宫颈癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤的细胞学筛查之用。文档编号C12Q1/42GK101781675SQ20101030081公开日2010年7月21日申请日期2010年1月27日优先权日2010年1月27日发明者谢佐福申请人:福建泰普生物科学有限公司