专利名称:一种牛支原体检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开一种牛支原体抗体检测试纸条。本实用新型的试纸条由底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，其中检测线包被的是山羊抗牛二抗IgG，质控线为兔源P48融合蛋白的多抗IgG。本实用新型的试纸条可检测牛支原体抗体，包括血清抗体与乳清抗体，并具有成本低，操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，检测敏感度高，特异性强，应用范围广等优点。
【专利说明】一种牛支原体检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种生物检测试纸条，确切讲本实用新型涉及一种牛支原体抗体检测试纸条。
【背景技术】
[0002]牛支原体是一种严重的致病性病原体，能够引起牛呼吸道疾病、奶牛乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、生殖道炎症以及流产与不孕等多种疾病，并且一旦感染能够引起其它病原的继发感染,例如化脓性隐秘杆菌,多杀性巴氏杆菌,溶血性曼氏杆菌、昏睡嗜血杆菌、牛副流感病毒3型、疱疹病毒I型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒等。牛支原体发病率为50%-100%，病死率高达10%-50%，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。本病在我国的实际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺乏有效的牛支原体检测的相关技术。
[0003]目前存在的检测牛支原体的技术有:1.病原分离鉴定，但是牛支原体分离往往受到临床应用抗生素的影响，分离困难，且分离用培养基营养要求高、分离物鉴定难度大、灵敏度低，不能做为早期快速诊断牛支原体感染的方法，也难以作为常规检测方法普及推广(出自 Caswell J L, Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle);2.PCR检测方法(出自 Thomas A, Dizier I, Linden A, et al.Conservat1n of the uvrC genesequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis),该检测方法需要对病料样品进行较复杂的处理(研磨、离心、提取DNA等)，检测方法虽灵敏，但容易因污染和处理不当比较容易出现假阳性，影响判定结果的准确性，此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，以及较高成本，不适合临床或基层使用。3.间接ELISA是目前应用最主要的血清学检测方法，国际上先后有用全菌蛋白包被和表达蛋白作为包被抗原的方法(出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al.Serological prevalence of Mycoplasma bovisinfect1n in suckling beef cattle in France),全菌蛋白的方法特异性不足现已很少应用，表达蛋白抗原ELISA方法目前已有商业化产品，但其所用哪一个抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法仅适合在实验室进行检测，操作步骤相对复杂，需要专业人员进行操作，且需要一定的实验室条件和仪器设备进行检测和分析结果。4.利用P48重组表达蛋白包被绵羊红细胞建立的间接血凝检测方法，操作相对简单，但也需要2~3小时才可判定结果，灵敏性弱，需要特定的恒温培养箱。
【发明内容】
[0004]本实用新型提供一种可克服现有技术不足，能简捷、快速、灵敏的检测牛支原体血清抗体、乳清抗体的检测试纸条。
[0005]本实用新型的一种检测牛支原体抗体的试纸条由底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维素膜上包被有质控线与检测线，本实用新型试纸条中的胶体金垫包被的抗原为牛支原体P48融合蛋白，检测线包被的是山羊抗牛二抗IgG，质控线为兔源P48融合蛋白的多抗IgG。
[0006]本实用新型有如下优点:
[0007](I)本实用新型中包被胶体金的抗原P48蛋白为牛支原体膜蛋白，具有很强的特异性，能真实地检测牛支原体抗体，包括血清抗体与乳清抗体；
[0008](2)本实用新型中的P48蛋白为原核表达可溶性蛋白，纯度高，活性高，检测抗体敏感性高，特异性强，应用范围广泛；
[0009](3)成本低，操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在15min内完成，比间接血凝试验以及ELISA试验节约成本，测试结果呈现肉眼可见的颜色反应，无需特殊仪器，无需特定的操作人员，可方便用于牛支原体流行病学调查以及在基层推广使用；
[0010](4)标记物稳定，标记样品在4°C贮存两年年以上，无信号衰减现象；
[0011](5)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，且对人体无毒害。
【附图说明】
[0012]图1为本实用新型的试纸条示意图，图中:1样品吸收垫，2胶体金垫，3检测线T，4质控线C，5吸水垫，6底板，7硝酸纤维膜.
[0013]图2为本实用新型的试纸条对标准阳性血清和阴性血清检测结果图，其中:1为样品稀释液的空白对照；2为阴性血清；3为牛支原体阳性标准血清；(注:由于血清粘稠，检测前先将阴性血清及阳性血清均稀释10倍，再进行检测)。
[0014]图3为本实用新型试纸条对于不同梯度稀释的阳性标准血清的检测结果图，I为样品稀释液的空白对照；2为阴性血清；3为牛支原体阳性标准血清1:10稀释；4.为牛支原体阳性标准血清1:100稀释；5为牛支原体阳性标准血清1:1000稀释；6为牛支原体阳性标准血清1:10000稀释；7为牛支原体阳性标准血清1:100000稀释；8为牛支原体阳性标准血清1:200000稀释。
[0015]图4为本实用新型试纸条特异性试验检测，1.为牛支原体阳性标准血清；2.丝状支原体山羊亚种阳性标准血清；3.猪肺炎支原体阳性标准血清；4.牛巴氏杆菌阳性标准血清；5.牛肺疫阳性标准血清；6.牛生殖道支原体阳性标准血清；7.绵羊肺炎支原体阳性标准血清；8.山羊支原体山羊肺炎亚种阳性标准血清；(血清均为1:10稀释)。
【具体实施方式】
[0016]本实用新型以下结合实施例解说。
[0017]1.P48蛋白的表达及纯化
[0018]1.1序列合成及重组质粒构建
[0019]牛支原体p48基因(Genebank: NC_014760.1)，本实用新型对该序列密码子进行了优化，按照密码子在大肠杆菌的嗜好进行优化，同时将在牛支原体该序列中的4个表达色氨酸的TGA (UGA)优化成TGG (UGG)，因为该密码子在大肠杆菌中为终止密码子，同时在其两端加上了酶切位点BamHI和Xho I ；
[0020]将优化后的p48基因序列交由Invitrogen公司合成到pet32a表达载体质粒中，合成后，进行测序鉴定，酶切鉴定，将鉴定成功后的阳性重组质粒命名为Pet32-a (+) -p48。
[0021]1.2P48蛋白的表达
[0022]将带有目的基因的重组质粒pet32a(+)_p48转化到感受态细胞BL21 (DE3)，挑取2个已转化到BL21 (DE3)的单菌落分别接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于37°C摇床中，220rpm震荡培养至OD值至0.6左右，然后吸取该1ml的菌液接种到新的IL含氨苄青霉素100ug/ml的LB液体培养基，在16°C，0.0lmmol/IIPTG浓度下诱导表达20h，收集菌体，用10ml的PH7.2PBS重悬，并进行冰上超声破碎30min。然后将超声处理的液体置于离心机中IlOOOrpm离心30min,弃去沉淀,收集上清100ml。
[0023]1.3亲和层析柱纯化P48蛋白及纯化蛋白的透析
[0024]用镍离子亲和层析方法纯化P48重组蛋白。先将5mL N1-NTA His Bind Resin(购自于南京金斯瑞生物科技公司)装入空层析柱，让液体靠重力作用自然滴出后，层析柱用20倍柱体积的平衡Buffer洗涤，然后将样品上清加到层析柱中，冰上结合60min然后让其流出；层析柱用20倍柱体积的NTA-10洗涤杂蛋白；然后分别用6个柱体积的NTA-60洗脱Buffer进行洗脱，每5ml收集一次，得到纯化后蛋白。
[0025]将第一个体积纯化的蛋白，第二个体积纯化的蛋白，第三四个体积纯化蛋白合并，第五六个体积纯化蛋白合并，分别装入透析袋，放入5L装有透析液的大烧杯中，透析液为0.1MPB缓冲液，放入4 °C冰箱透析过夜，第二天取出，将透析好的P48蛋白装入EP管放入_40°C冰箱保存(ImL/管)。
[0026]2.胶体金试纸条的制备过程
[0027]2.1胶体金制备过程
[0028]取1%氯金酸水溶液Iml加入10ml去离子水中，在控温搅拌器口加热至沸腾，再迅速一次性加入1%柠檬酸三钠1.5ml，持续加热煮沸15min，然后用水补齐至10ml即获得均匀透明的胶体金溶液。
[0029]2.2胶体金标垫的制备
[0030]用上述方法得到的纯化后透析的P48重组蛋白包被胶体金并制备胶体金垫，抗原结合胶体金的pH值为7.4,胶体金包被P48蛋白的最佳浓度为6ug/ml,抗原包被金颗粒的时间为30min，在抗原结合后加入20% BSA 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后利用重悬液将胶体金颗粒重悬，制备胶体金标垫，37°C干燥3小时。其重悬液配方为:0.02M四硼酸钠、0.5% BSA, 3%蔗糖、0.5%酪蛋白，0.5%吐温20。
[0031]2.3硝酸纤维素膜上质控线与检测线的包被
[0032]本实用新型试纸条硝酸纤维素膜型号为M135，购买于MILLIP0RE (美国)，包被硝酸纤维素膜检测线的所用抗原为lOOug/ml亲和纯化山羊抗牛二抗IgG，包被检测线Iul/cm,该亲和纯化山羊抗牛二抗购买于ImmunoReagents试剂公司。
[0033]包被硝酸纤维素膜质控线抗原为P48蛋白多抗IgG，利用其浓度为200ug/ml，包被质控线lul/cm。该IgG是用高免血清经过纯化而得。高免血清的制备方法如下:
[0034]高免血清制备中所用弗氏完全佐剂抗原和弗氏不完全佐剂抗原的配制，其中:弗氏完全佐剂抗原:弗氏完全佐剂3mL加lmg/mlP48蛋白抗原3mL ;弗氏不完全佐剂抗原:弗氏不完全佐剂3mL加lmg/mlP48蛋白3mL。
[0035]上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。
[0036]P48蛋白高免血清制备过程:
[0037]a.首先，选用2kg左右、12月龄的健康雄性新西兰大白兔。
[0038]b.取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，胭淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为1.5mL ；14日后仍以弗氏完全佐剂抗原1.5ml由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔14日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔脚掌两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；
[0039]c.隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，免疫兔血清IHA效价达1:512,正式采血,3000rpm离心5min分离血清，即为P48蛋白高免血清。
[0040]d.用饱和硫酸铵沉淀法将分离到的血清纯化获得P48蛋白多抗IgG。
[0041]2.4试纸条组装
[0042]操作按如下步骤进行在PVC背衬板上由上至下分别将包括检测线和质控线的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫、以及吸收垫按顺序装配，将PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上部左端贴有吸收垫，硝酸纤维素膜上部右端设有金标垫，金标垫的上部右端设有样品垫，再分别用喷枪将前述得到的亲和纯化山羊抗牛二抗IgG以及纯化的P48多抗IgG在硝酸纤维素膜上制出检测线和质控线，在本实用新型试纸条中检测线与质控线两线间距离保持在0.Smm0再将试纸切割成4_宽的条状，即制成如附图1的结构本实用新型的检测牛支原体抗体的胶体金试纸条示意图。
[0043]本实用新型的试纸条原理为双抗原夹心法检测抗体，其中判定标准为质控线显色的前提下，检测线显色呈阳性；检测线无显色，呈阴性。若质控线不显色，则失效，需要重新测定。
[0044]本实用新型胶体金试纸条分别对阳性血清和阴性血清进行检测，结果见附图2，由附图2可见，阳性血清显示检测线和质控线两条线均为红色；阴性质控线显色，检测线不显色；空白对照仅为样品稀释液结果为质控线显色，检测线不显色。其中样品稀释液为含0.5%吐温20的0.1MPBS缓冲液。
[0045]本实用新型胶体金试纸条对阳性血清不同稀释度进行检测，结果见附图4，由附图3可见，阴性血清、样品稀释液空白对照均质控线显色，检测线不显色。阳性血清1:10、1:10U:1000,1:10000,1:100000均为质控线与检测线均显色，呈现阳性；而阳性血清1:200000仅质控线显色，呈现阴性，因此该发明中试纸条灵敏度能够达到，而之前建立的牛支原体间接血凝检测方法仅能检测到1:4096，所以该发明大大提高了检测敏感度。
[0046]本实用新型试纸条特异性试验检测结果见附图4，其中检测了牛支原体阳性标准血清，丝状支原体山羊亚种阳性标准血清，猪肺炎支原体阳性标准血清，牛巴氏杆菌阳性标准血清，牛肺疫阳性标准血清，牛生殖道支原体阳性标准血清，绵羊肺炎支原体阳性标准血清以及山羊支原体山羊肺炎亚种阳性标准血清，结果仅由牛支原体阳性血清呈现阳性，其余相似支原体以及能够引起牛相似病症的病原抗体均呈现阴性，证明该试纸条特异性好，结果可靠。
[0047]利用进口 ELISA试剂盒与本实用新型的试纸检测进行了对比，检测明确背景的阴性样品(含乳清、血清)共83份，阳性样品(含乳清、血清)共189份，其中进口 ELISA试剂盒检测阴性血清90份，阳性血清182份，而该发明中试纸条检测结果阴性血清86份，阳性血清186份。与进口 ELISA试剂盒检测对比，阴性符合率为95.6%，阳性符合率为97.8%，而进口 ELISA试剂盒检测样品的成本高达5元/份，而且操作需要3个小时左右才能出检测结果，而本实用新型中试纸条成本0.5元/份，仅在15min内就可以呈现清晰、明了的结果，大大降低了成本，提高了效率。
【权利要求】
1.一种检测牛支原体抗体的试纸条，该试纸条由底板、设置于底板上依次线性排列的样品吸收垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜和吸水垫组成，在硝酸纤维膜上包被有质控线与检测线，其特征在于:胶体金垫包被的抗原为牛支原体P48融合蛋白，检测线包被的是山羊抗牛二抗IgG，质控线为兔源P48融合蛋白的多抗IgG。
【文档编号】G01N33-68GK204287202SQ201420655524
【发明者】储岳峰, 简莹娜, 赵萍, 陈胜利, 贺英, 逯忠新, 刘永生 [申请人]中国农业科学院兰州兽医研究所