一种用于检测大豆脂肪酸脱氢酶合成基因a3型突变的引物组及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于检测大豆脂肪酸脱氨酶合成基因A3型突变的引物组及应 用，属于植物分子标记开发和作物分子辅助选择技术领域。
【背景技术】
[0002] 大豆为人类提供重要的植物油份，并且大豆的含油量是大豆最重要的经济性状。 商品大豆油主要包括大约11 %的软脂酸（16:0) ,4%的硬脂酸（18:0) ,25%的油酸（18:1)， 52%的亚油酸（18:2)和4%的亚麻酸（18:3HFe虹，2007)。中国各地区的气候、±壤、水质 等自然条件W及品种选育方向均存在差异，为大豆种质资源品质特性的丰富变异创造了条 件，有利于筛选优异脂肪酸组成的大豆种质（盖均锐等，2001)。不饱和脂肪酸为人体必需 脂肪酸，在人体新陈代谢中具
[0003] 有重要的生理功能，油酸可有效降低血液中总胆固醇和有害胆固醇含量，营养学 家称之为"安全脂肪酸"，亚油酸具有抑制癌症，预防糖尿病和减少体内脂肪，减少血液中胆 固醇量，防止动脉硬化的作用，亚麻酸具有溶血栓，降血压防血小板凝集，健脑抗衰老等作 用（陈学珍，2004)。在大豆油脂中的不饱和脂肪酸具有重要的生理保健作用，不饱和脂肪 酸中油酸的稳定性最好，提高其含量可W延长贬藏期，但由于亚油酸和亚麻酸分别含有2， 3个不饱和双键，容易使油脂氧化变质，造成豆油及其食品味道不佳，营养价值降低。另外， 由于饱和脂肪酸能量低，不易消化吸收，过多食用会导致肥胖病和屯、血管疾病（杨柳等， 2006)。因此，提高油酸含量，降低亚油酸含量是大豆品质育种的重要目标之一。
[0004] 在油脂的合成途径中，脂肪酸脱氨酶2 (FAD2)在油酸前体向亚油酸前体的转变过 程中起到了至关重要的作用（Okul巧等，1994 ;Schlueter等，2007)，在发育的大豆种子中， 2 个脂肪酸脱饱和酶GmFAD2-lA(Glymal0g42470)和GmFAD2-lB(Glyma20g24530)表达水平 最高，因此该2个基因被认为是控制大豆油酸含量的候选基因，并且越来越多的研究者通 过改造该2个目标基因来培育高油酸含量的优质大豆品种。基因工程和候选基因分子育种 策略被用来培育高于80%油酸含量的优质大豆炬U虹等，2002出oshino等，2010 ;化am等， 2010)，该些研究成果证明了在GmFAD2-lA和GmFAD2-lB基因中的突变程度越严重，大豆油 脂中的油酸含量越高，同时油脂的稳定性也越强。
[0005] 我国作为大豆的发源地，具有丰富的大豆种质资源。目前，我国作物种质资源库己 保存的大豆种质资源达3万余份，居世界之首（汪越胜，2002)。然而利用传统的油分鉴定 方法对数目庞大的大豆资源进行鉴定工作量大，周期长的问题，目前尚没有一种能够快速 并且准确地检测控制大豆高油酸含量的A3型突变位点的方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种大豆脂肪酸脱氨酶合成基因A3型突变位点 的快速检测方法，所采取的技术方案如下：
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种用于检测大豆脂肪酸脱氨酶合成基因A3型突变 的引物组，该引物组的核巧酸序列如SEQIDNO. 1-4所示。
[000引本发明的另一个目的在于提供一种利用所述引物组检测大豆脂肪酸脱氨酶合成 基因A3型突变的方法，该方法是W待测样品的DNA为模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2 所述序列为引物进行第一轮PCR扩增，稀释扩增产物后，再W稀释后的扩增产物为模板，W 如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序列为引物进行第二轮PCR扩增，最后利用高分辨率烙 解曲线分析仪器对第二轮扩增产物进行基因型突变检测。
[0009] 所述方法的步骤如下：
[0010] 1)提取待鉴定材料的DNA;
[001U2)W步骤1)所得的DNA为模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列为引物 进行第一轮PCR巢式扩增，获得扩增产物后，进行稀释处理；
[001引如W步骤。中稀释后的扩增产物为模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述序 列为引物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增结束后获得第二轮扩增产物；
[0013] 4)利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分 辨率烙解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测。
[0014] 优选地，步骤2)所述第一轮巢式PCR处理，PCR扩增条件为；94°C预变性4min， 94°C变性40s，6rC退火30s，72°C延伸15s，共35个循环，再72°C延伸4min，4°C保温；所述 稀释处理，是利用d地2〇稀释10倍。
[0015] 优选地，步骤3)所述第二轮巢式PCR处理，PCR扩增条件为；94°C预变性4min， 94°C变性40s，59°C退火30s，72°C延伸10s，共15个循环，再72°C延伸4min，4°C保温。
[0016] 优选地，步骤4)所述利用高分辨率烙解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因 型突变进行检测，是根据目标片段的GC含量的变化在不同烙解温度出现吸收峰的位置判 定，突变株的GC含量下降，溶解温度降低，吸收峰在左侧；野生型GC含量高，烙解温度高，吸 收峰在右侧；杂合型的GC含量居中，吸收峰位于中间温度。
[0017] 所述方法的具体步骤如下：
[00化]1)提取待鉴定材料的DNA;
[0019] 。W步骤1)所得的DNA为模板，W如SEQIDNO. 1-SEQIDNO. 2所述序列为引 物进行第一轮？〔3扩增，？0?扩增条件为；941：预变性4111111，941：变性4〇3,611：退火3〇3， 72°C延伸15s，共35个循环，再72°C延伸4min，4°C保温，获得扩增产物后，利用d地20稀释 10倍；
[0020] 3)W步骤2)中稀释后的扩增产物为模板，W如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 3所述 序列为引物进行第二轮PCR扩增，PCR扩增条件为；94°C预变性4min，94°C变性40s，59°C退 火30s，72°C延伸10s，共15个循环，再72°C延伸4min，4°C保温，扩增结束后获得第二轮扩 增产物.
[0021] 4)利用20矿物油将步骤3)所得的第二轮扩增产物覆盖成混合样品，再利用高分 辨率烙解曲线分析仪器对第二轮扩增产物的基因型突变进行检测，并将所得烙解曲线与野 生型和杂合型样品的烙解曲线进行对比，当待测样品的烙解温度降低，烙解曲线位于野生 型和杂合型样品的左侧时，该待测样品即为A3型突变株。
[0022] 所述任一方法用于大豆的遗传育种。
[0023] 利用所述引物组制备的检测试剂盒。
[0024] 所述试剂盒用于筛选和鉴定大豆脂肪酸脱氨酶合成基因A3型突变体。
[0025] 本发明有益效果：
[0026] 本发明是在克隆出的大豆脂肪酸脱氨酶合成基因GmFAD2-lA基础上，通过比较高 油酸大豆A3和普通油酸含量大豆BAY的GmFAD2-lA基因序列，首次发现了位于76化P处的 单碱基突变佑一A)，且该突变导致油酸含量变化。
[0027] 本发明针对A3突变位点设计了 2套分子标记（外部引物和内部引物，引物如序列 表所示）进行巢式PCRW确保扩增的特异性，并利用高分辨率烙解曲线分析仪器进行突变 位点检测。本发明开发的分子标记的使用方法为；首先利用外部引物进行第一轮PCR扩增， 随后将PCR产物稀释10倍作模板，且W内部引物进行第二轮PCR扩增，最后将PCR产物转 移至高分辨率烙解曲线分析仪器中进行基因型突变检测。该突变位点的分子标记开发对于 高油酸大豆的分子标记辅助选择具有重要意义。
【附图说明】
[002引图1为GmFAD-2-lA(