对霍乱弧菌o18，o19，o23和o12特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对霍乱弧菌018, 019, 023和012血清型特异的核苷酸，尤其涉及对霍 乱弧菌018, 019, 012和018血清型0抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 霍乱弧菌（Vibriocholerae)属于弧菌属，是霍乱的病原菌，霍乱是一种烈性肠道 传染病，是流传时间长、影响范围广的一种食源性疾病，其典型临床表现为腹泻、呕吐和由 此引起的体液丢失、脱水、周身循环衰竭、电解质紊乱、低钾综合症、腹部痉挛甚至死亡，被 世界卫生组织确定为必须国际检疫的传染病之一，《中华人民共和国传染病防治法》将其列 为应实施"强制管理"的甲类传染病。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的〇抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 霍乱弧菌的分子鉴定越来越受到人们的重视，成为霍乱弧菌菌种与株型鉴定的重 要依据，不少新菌也因此产生。对弧菌而言，生化反应主要是各种酶谱的表现，属于外部形 态的内容，核酸的相似性才是弧菌种的界定最根本、最直接的特征。因此，霍乱弧菌的分型 与鉴定最有效、最直接的方式应该从核酸的研究触发，通过比较核酸(包括基因组与核酸片 段）的相似性确定霍乱弧菌的归属。
[0005] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于霍乱弧菌的快速血清分型筛查，稳定的 鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式 反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵 敏、特异性强等优点。
[0006] 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备 细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部 门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
[0007] 不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为霍乱弧菌的防控 提供有效技术支持是十分重要的。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供了一种对霍乱弧菌0抗原特异的核苷酸，其特征在于所述 的核苷酸具有： 1)SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一种； 2)与SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种；所述的SEQIDNO: 1-8 如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mMdNTP30y1 ; 10X酶特异性反应缓冲液50yI;5U/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;引物混合 物10y1;阳性对照品10y1;阴性对照品10yI;ddH2〇 5ml。
[0009] 其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO: 1-8所示的核苷酸中的至少一种。
[0010] 本发明进一步公开了一种对霍乱弧菌〇抗原特异的SEQIDNO: 1-8核苷酸在制备 用于检测霍乱弧菌0抗原PCR试剂盒、基因芯片或微阵列方面的应用。
[0011] 本发明所述霍乱弧菌可以取样于自来水、霍乱水、海水、土壤的培养物的粗提液， 或是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液等。
[0012] 收集霍乱弧菌提取基因组是米用常规方法制备获得。
[0013] 针对霍乱弧菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结 果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样 本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
[0014] 本发明还提供一种基因芯片，包括固相载体和固定在固相载体上的寡核苷酸探 针，其中所述寡核苷酸探针包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQIDNO: 1-8所 示的核苷酸。
[0015] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ IDNO: 1-8所示的核苷酸。检测变形杆菌的基因芯片方面、检测变形杆菌微阵列方面的应 用。所述的变形杆菌指的是检测霍乱弧菌指的是检测由于污染水源和未煮熟的食物中毒、 腹泻、肠道传染病、医院内感染等多种混合型感染的细菌。
[0016] 本发明公开的一种对霍乱弧菌0抗原特异的核苷酸与现有技术相比，本发明具有 如下优点： (1)实用性强：本发明建立的一种PCR反应体系，可检测霍乱弧菌，提供血清分型检测 所用到的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。
[0017] (2)准确性高：本发明通过对霍乱弧菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样 品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到霍乱弧菌所属的血 清型。
[0018] (3)检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验 检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。
[0019] 以上所述，仅是本发明的操作和实施方法而已，并非对本发明作任何形式上的限 制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍 属于本发明技术方案的范围内。
[0020]
【附图说明】： 图1表示本发明018血清型特异引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株电泳结果图，rzz基因Pl和P2引物的筛选，目的条带为198bp，其余的血清型没有任何条带具体菌株信 息见表2 ; 图2表示本发明018血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 6株弧 菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本发明019血清型wzm基因P3和P4引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，wzm基因P3和P4引物的筛选，目的条带为264bp，其余的血清型没有任何条 带。具体菌株信息见表2; 图4表示本发明019血清型wzm基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2 ; 图5表示本发明023血清型rzz基因P5和P6引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，rzz基因P5和P6引物的筛选，目的条带为250bp，其余的血清型没有任何条 带，具体菌株信息见表2; 图6表示本发明023血清型rzz基因P5和P6引物种特异性的鉴定；电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图7表示本发明012血清型rM基因P7和P8引物检测霍乱弧菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，r湖基因P7和P8引物的筛选，目的条带为262bp，其余的血清型没有任何条 带。具体菌株信息见表2; 图8表示本发明012血清型rM基因P7和P8引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2 ; 图9表示分别用018, 019, 023和012特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具体菌 株信息见表2 ; 其中018、019、023、0 12、和负对照（-)表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳道H 和最后一个泳道是2000bpladdermarker。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。其中霍乱弧菌来源于JapanCollectionofMicroorganisms (JCM)〇
[0022] 实施例1:基_组的提取 37°C营养肉汤培养基培养霍乱弧菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和IOul0. 4MEDTA重悬细胞，37°C温育 20 分钟，然 后加入IOullOmg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C温育2小时，再加入3ullOmg/ml的RNase，65°C温育30分钟。加等体积酚 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0023] 实施例2:序列破译 提取霍乱弧菌各个血清型标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测序技术对霍乱 弧菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast及PSI-Blast 进行序列比对，采用TMHMM2.0program进行跨膜结构预测，运用ClustalWprogram进行 序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得霍乱弧菌各个血清型的〇抗原基因簇序列 及破译结果。
[0024] 实施例3:引物设计 霍乱弧菌各个血清型的0抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，我们选 取Blast比对结果identity和similarity值相对较低的基因特异区段设计引物。其中 018血清型的r從基因比对结果iden