tity值和similarity值为91%和95% ;019血清型的 r湖基因比对结果identity值和similarity值为84%和93% ;023血清型的r從基因比对 结果identity值和similarity值为90%和94% ;012血清型的r湖基因比对结果identity 值和similarity值为100%和100% ;所以各个血清型分别选取上述对应的基因作为该血清 型的特异靶基因，针对各个血清型的基因特异区段分别设计特异引物。
[0025] 引物设计是该发明的核心部分。将上述基因导入PrimerPremier5进行引物设 计，每个基因设计一对引物，有单一目的条带。
[0026] 引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列 相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或 者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验 的成败十分重要。
[0027] 设计出的引物如表1所示。
[0028] 表1 用于PCR的引物序列
实施例4:特异引物的筛诜 收集了霍乱弧菌018、019、023及012血清型的标准菌株，6株弧菌属其他菌株，1株沙 门菌属菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表2. 表2用于特异性检测的菌株
基因鉴定引物筛选用到的PCR体系为5yM引物0.4yI、10X酶特异性反应缓冲液2. 5y1、IOmMdNTP0?25y1、5U/y1耐热DNA聚合酶0?2y1及3y1的待测样品模板到 0.2ml的薄壁PCR管中，最后CldH2O补足到25yl。所有引物都在各自所对应的血清型中得 到阳性结果，在其他组中没有得到任何PCR产物带。
[0029] 这个步骤中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时 间、循环次数，具体为： 前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95°C，5分 钟； 变性温度和时间为95°C，45秒； 复性温度和时间为55°C/68°C，1分钟； 延伸温度和时间为72°C，1分钟； 变性、复性、延伸的循环次数为35个循环； 为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72°C，5分钟 其中，018使用64°C扩增，019使用61°C扩增，023使用55-65°C扩增，012使用55-58°C 扩增均可。
[0030] 上述步骤在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为： 戀取2~5ii1扩增产物与6X溴酚蓝上样缓冲液以1 :1的体积比混合； 蠢将混合液上样于1. 0 %的琼脂糖凝胶上； _将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约20分钟，用DL2000Marker进行对照； 變观察并记录结果。
[0031] 通过基本PCR反应之后引物筛选的工作基本结束，必要的长度调整对整体反应条 件影响不大，本发明中用到的引物序列全部总结在表1中。
[0032] 表1 用于PCR的引物序列
实施例5:PCR检测试剂盒的制备及应用UPCR试剂盒的组成： dNTP(IOmM) 30y1 ； 10 XBuffer(10 X酶特异性反应缓冲液） 50y1 ; Taq聚合酶（5U/y1耐热DNA聚合酶） 5y1 ; PCR引物混合物（5yM) IOyl； 阳性对照品（KP) IOyl； 阴性对照品（KN) IOyl； ddH20 5ml; 每个试剂盒可用于检测10个样品。
[0033] 其中IOXBuffer、dNTP、Taq聚合酶由宝生物工程有限公司提供；引物混合物为 自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和CldH2O由我 们自行制备。
[0034] 2、仪器设备 其中IOXBuffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物为自行设计的序列 提供给上海英骏生物技术公司合成；阳性对照品、阴性对照品和ddH20由我们自行制备。 实验的设备PCR仪(又名DNA热循环扩增仪)、电泳设备(包括电泳仪及电泳槽)、凝胶成像 仪、-20°C冰箱、高速离心机、微量移液器和0. 2mlPCR薄壁管。
[0035] 3、PCR试剂盒的使用具体实例 使用上述的PCR试剂盒检测霍乱弧菌的PCR检测方法包括如下步骤： (1)提取待测环境样品模板； (2 )在PCR薄壁管中加入、dNTP、IO X Buf fer、Taq聚合酶、引物、待测样品模板和ddH20 混匀； (3) 将薄壁PCR管中混匀的混合物在PCR仪上扩增； (4) 在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果； (5) 分析并进行结果判断。
[0036] 上述步骤⑴中的环境样品模板为自来水、霍乱水、海水等的培养物的粗提液，或 是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液或是纯DNA，或是阳性对照品和阴性对照品。
[0037] 上述步骤（1)中的环境样品模板的提取方法为： _取I. 5ml培养物，在12000rpm条件下离心1分钟，去掉上清液； #取500以1的CldH2O重悬沉淀，在8000rpm条件下离心5分钟，去掉上清液，烘干； _取100yIddH2O重悬沉淀，在IOOcC沸水中水浴10分钟； 變再置于冰上10分钟后，在12000rpm条件下离心2分钟； ⑤取3 y 1中层上清作为PCR模板 上述步骤（3 )中的PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、 循环次数，具体为： 前期为使变性能够达到所需的温度而必需的前期处理过程的一个循环为95°C，5分 钟； 变性温度和时间为95°C，45秒； 复性温度和时间为55°C/68°C，1分钟； 延伸温度和时间为72°C，1分钟； 变性、复性、延伸的循环次数为35个循环； 为稳定扩增产物而进行一个循环的温度和时间为72°C，5分钟。
[0038] 上述步骤（4)在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果的具体步骤为： (D取2~5y1扩增产物与6X溴酚蓝上样缓冲液以5 :1的体积比混合； ③将混合液上样于1. 0 %的琼脂糖凝胶上； ③ 将琼脂糖凝胶电泳120v稳压电泳约20分钟，用DL2000 Marker进行对照； ④ 观察并记录结果。
[0039] 本发明通过配置一种可检测霍乱弧菌的可产业化生产的PCR试剂盒，将PCR检测 方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作层序就 可以进行快速、灵敏、简便的检测，试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂 盒检测霍乱弧菌所使用的试验设备简单，检测成本低。
[0040] 使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。 若含有霍乱弧菌目的0抗原类型，则从电泳结果中可以观察到与阳性对照品相同位置的条 带；若不含有霍乱弧菌目的〇抗原类型，则与阴性对照品一样不具有这一条带。
[0041] 本发明一次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量见下表3所示，DNA模板量为 3y1 表3 -次检测试验所使用的试剂盒中的试剂量
本发明中的耐热DNA聚合酶为Taq酶。
[0042] 上述的阳性对照品为已确定是霍乱弧菌各个0抗原类型的样品，阴性对照品则为 经实验室确定不是霍乱弧菌的样品。
[0043] 本PCR试剂盒若用霍乱弧菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模 板所得结果一直。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板DNA的提取步骤，使操作方法 得以简化。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样 品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可以进行检测，因而节省了人力物力。
[0044] 4、待测样品的提供 收集了霍乱018、019、023、及012血清型标准菌株，6株弧菌属其他菌株，1株沙门菌属 菌株以及1株大肠杆菌菌株验证引物的特异性，菌株编号和来源见表2。
【主权项】
1. 一种对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1. SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸中的至少一种； 2) 与SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。2. 权利要求1所述对霍乱弧菌0抗原特异的核苷酸，其特征在于上述核苷酸可以用于 制备检测霍乱弧菌用PCR试剂盒、基因芯片或微阵列；所述霍乱弧菌可以取样于自来水、霍 乱水、海水的培养物的粗提液，或是霍乱弧菌的纯培养物的粗提液。3. -种PCR试剂盒，其特征在于包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引 物为如SEQ ID NO: 1-8所示的核苷酸中的至少一种。4. 权利要求2所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mM dNTP 30yl ;10X酶特异性反 应缓冲液50 y I ;5U/ y 1耐热DNA聚合酶5 y 1 ;引物混合物10 y 1 ;阳性对照品10 y 1 ;阴 性对照品 IOy I ;ddH20 lml。5. 权利要求1所述的SEQ ID NO: 1-8核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌PCR试剂盒方面 的应用。6. 权利要求1所述的SEQ ID NO: 1-8核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌的基因芯片方面 的应用。7. 权利要求1所述的SEQ ID NO: 1-8核苷酸在制备用于检测霍乱弧菌微阵列方面的应 用。8. 权利要求6-7所述的应用，其中所述的检测霍乱弧菌指的是检测由于污染水源和未 煮熟的食物中毒、腹泻、肠道传染病、医院内感染多种混合型感染的细菌。
【专利摘要】本发明涉及一种对霍乱弧菌(Vibro？cholerae)O抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1）SEQ？ID？NO:1-8所示的核苷酸中的至少一种；2）与SEQ？ID？NO:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测霍乱弧菌用PCR试剂盒和基因芯片。本发明的对霍乱弧菌O抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片的实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105087569
【申请号】CN201510562604
【发明人】王磊, 许广楠, 张新杰, 王敏, 王来友
【申请人】南开大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月7日