一种人2号染色体新型快速fish探针的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人2号染色体新型快速FISH探针的制备方法及其应用的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]焚光原位杂交(FISH,fluorescence in situ hybridizat1n)是一项在体外直接观察细胞中特定核酸的技术。根据碱基互补配对的原则，特定的DNA序列与细胞内的目标序列互补结合。由于探针带有荧光，在合适的激发光照射下，杂交探针及目标DNA能够在荧光显微镜下被清楚地观察到，是一种直观有效的检测方法。
[0003]由于传统FISH探针序列的长度较大，导致所需要的杂交时间很长(一般是过夜杂16-18小时)，不能及时的得到检测结果，这不利于临床的诊断及治疗。对FISH探针进行改进，缩短杂交时间，提尚检测效率，有利于临床的诊断及治疗。
[0004]有必要研究出一种新型快速FISH探针的制备方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种人2号染色体新型快速FISH探针的制备方法及其应用。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
人2号染色体新型快速FISH探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，2号染色体特异性探针的序列为:
探针 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探针 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探针 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探针 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探针 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探针 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探针 7: GTGTTGAAGCATTCTTTTGA
上述检测试剂盒中的使用的探针中，2号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。
[0007]上述探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。
[0008]上述探针所用缓冲液为:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10%?30%甲酰胺。
[0009]上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明试剂盒，采用优化的短序列荧光探针，将原有的FISH检测时间由16?18小时缩短至I?2小时，可以快速、准确地检测出人2号染色体，对未来染色体异常快速检测方法的探究起指示性作用。
【附图说明】
[0011]图1是人2号染色体经本试剂盒荧光探针染色后的检验结果。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:
一、人2号染色体新型快速FISH探针，包括FISH荧光探针，缓冲液和染色液，其中，人2号染色体特异性探针的序列如下，
探针 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探针 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探针 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探针 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探针 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探针 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探针 7: GTGTTGAAGCATTCTTTTGA
其中，人2号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。该探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。
[0013]实验时，加入10ul的缓冲液溶解探针干粉，缓冲液的成分为:20mM?50mMTris-HCl (PH8.0 ?8.8)，1mM MgCl2,10% ?30% 甲酰胺。
[0014]上述探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
[0015]二、FISH 检测:
1.羊水样本处理
1)取彡5ml羊水转移到15ml的离心管(标记)中，2000rpm室温离心10分钟；
2)观察并记录沉淀情况，上清(约4ml)转移到新15ml离心管(标记)，置4°C冰箱中保存；
3)沉淀加入5mlIxPBS并混匀，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ；
4)加入5ml的0.05%胰酶溶液，反复吹打混匀，37°C放置5_10分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清，管底留约Iml ;
5)加入5ml0.075M KCl，反复吹打混匀，37°C孵育20分钟；
6)缓慢贴壁加入Iml的固定液，室温孵育5分钟，2000rpm室温离心10分钟，弃上清至约 Iml ；
7)沉淀吹打混匀，缓慢加入Iml固定液，轻柔吹打混匀。再加入5ml的固定液，放入-20°C冰箱中至少I小时以上；
8)2000rpm室温离心10分钟，尽可能吸尽上清；
2.滴片
I)视细胞沉淀量酌情加入固定液，吹打混匀，滴于(3ul悬液)准备好的干燥玻片上，自然晾干后于光镜下观察细胞密度，10倍镜下每一视野内细胞数不少于100个，根据镜检结果用新鲜固定液调整细胞悬液浓度，重新滴片备用； 2)室温下过夜老化或60°C热台烘烤30分钟老化备用；
3.杂交前处理
1)取出玻片，放入IXPBS室温洗涤3分钟；
2)取出玻片，放入1%多聚甲醛/PBS室温固定10分钟；
3)取出玻片，放入室温IXPBS中3分钟；
4)取出玻片，放入另一缸室温IXPBS中3分钟；
5)取出玻片，再将其依次放入室温70%，90%，100%梯度乙醇脱水各2分钟；
6)取出玻片，室温晾干。
[0016]4.杂交
I)从_20°C冰箱中取出探针干粉，震荡混匀，瞬时离心；加入10ul的缓冲液，混匀后作为杂交液。
[0017]2)加10 μ I的杂交液(含人2号染色体探针)到杂交区域，迅速盖上22 X 22mm盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；
3)用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；
4)将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性85°C:10分钟，杂交42°C:20分钟。
[0018]5.杂交后处理
1)将玻片取出，轻轻撕去橡皮胶，移去盖玻片(若盖玻片难以去除，可以将其放入洗液I中微微摇晃，以利于其脱落)；
2)玻片放入洗液中室温孵育5分钟；
3)取出玻片，再将其放入洗液中室温孵育2分钟；
4)取出玻片，自然干燥玻片；
6.镜检
相关荧光和DAPI需用合适的滤块观察；其中，2号染色体探针显示为绿色信号。
[0019]注意事项:FISH检测第4-6步需避光操作。
[0020]三、检测结果:
镜检结果如图1所示。从图中可以看出，本发明的检测试剂盒中所使用的探针可以与目的序列快速稳定的结合，产生荧光信号，检测结果准确可靠，同时大大缩短了人2号染色体荧光检测时间。
【主权项】
1.一种人2号染色体新型快速FISH探针的制备方法及其应用，通过NCBI Mapview数据库检索并下载人2号染色体的序列，在染色体着丝粒上找到重复性高，特异性好的序列作为人2号染色体的特异性探针，其中，人2号染色体特异性探针的序列如下， 探针 1:TGTGCGCCCTCAACTAACAGTGTTG 探针 2:ATATCTTCCCCTGAAAACTAGACAG 探针 3:AGCAATGTCAGAAACTTTTTCATGA 探针 4: CTCAGAAGCTTCATTGGGATGTTTC 探针 5:AGTGGATATTTGTCTAGCTTTG 探针 6: CCAATAAAAGCTACATAGA 探针 7:GTGTTGAAGCATTCTTTTGA。2.根据权利要求1所述的人2号染色体新型快速FISH探针，其特征在于'2号染色体特异性探针连接的荧光基团为绿色荧光基团。3.根据权利要求1，2所述的人2号染色体新型快速FISH探针，其特征在于:探针是在染色体上重复性高，特异性好的短序列。4.根据权利要求1，2，3所述的人2号染色体新型快速FISH探针，其特征在于'2号染色体特异性探针所用缓冲液为:20mM?50mM Tris-HCl (PH8.0?8.8)，1mM MgCl2,10%?30%甲酰胺。5.根据权利要求1，2，3，4所述的人2号染色体新型快速FISH探针，其特征在于:2号染色体特异性探针的杂交温度为42°C，杂交时间为20分钟。
【专利摘要】本发明涉及一种人2号染色体新型快速FISH探针的制备方法及其应用，用这种方法制备的人2号染色体特异性探针进行试验，试验结果表明，这种新型快速FISH探针能够在较短时间内准确地与人2号染色体进行定位，对未来染色体异常快速检测方法的探究起指示性作用。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105087561
【申请号】CN201510498574
【发明人】陈华云, 刘淑园, 陈嘉昌, 丁渭, 肖湘文, 黄爽, 曾烨, 刘孝礼, 方凤银
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月14日