专利名称：双探针基因芯片信号放大方法
技术领域：
本发明专利申请是下面相关专利申请技术内容的扩展和补充中国发明专利申请基因芯片联合处理系统及相关技术，申请号01126990.1。申请日2001年10月11日；基因芯片分子探针及相关技术，申请号01142654.3。申请日2001年12月14日。
微阵列信号放大方法，申请号03129124.4。申请日2003年7月23日。
国际专利申请基因芯片分子探针及相关技术，国际申请号PCT/CN02/00887。申请日2002年12月13日。
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Kaufman等人的美国专利US PAT 6,383,754。May 7，2002Linsley等人的美国专利US Pat 6,232,068，May 15，2001Carrico美国专利U.S.Pat.No.4,833,084，May 23，1989所属领域 本发明属于基因芯片应用技术领域，特别是涉及到基因芯片的杂交，标记，洗脱，信号检测及数据分析技术。
本发明技术背景 基因芯片是利用平行分析原理将大量不同序列的核酸分子，作为分析样品中靶基因的基因探针，以微点阵方式固化在硅片，玻璃，尼龙膜等基质上，从而制成通常意义上的基因芯片，或称为DNA微阵列(1-2)。至目前，基因芯片在信号标记方面仍然以CY3/CY5等荧光染料标记为主。这种标记试剂价格昂贵，而且灵敏度不高，在使用过程中对操作人员技术的要求也很高。另外，中国专利申请如本人的“基因芯片分子探针及相关技术，申请号01142654.3”和“微阵列信号放大方法，申请号03129124.4”虽提出了高荷信号载体进行信号放大的标记技术，通过杂交后对杂交双链核酸进行特异性标记，但这种方法对于来自不同样品的基因必须分两次基因芯片实验才能比较出不同样品中的基因含量。这种比较法在基因芯片的表达谱研究中尤为常见。目前通行的技术路线是用CY3[光激发后产生兰色荧光]、CY5[光激发后产生红色荧光]分别标记不同样品中的基因组，再将此不同标记的靶基因溶液在同一个基因芯片上进行杂交。通过最终显示出来的荧光颜色来确定某一基因在不同样品中的表达水平的差异。
但由于CY3/CY5在基因芯片检测中出现灵敏度不足和价格昂贵的问题，而且不适合于基因芯片在临床诊断方面的应用，所以，目前基因芯片在临床诊断领域的普及应用过程进展缓慢。
一种用来检测差异表达基因的方法是首先分别从处于健康和疾病状态的细胞、组织或器官用特异性的引物从样本中通过PGR扩增制备靶基因，或cDNA靶。在制备靶基因的合成中掺入了核苷单体dNTP及一部分与同位素[32P，33P，35S，125I]或荧光基团[如香豆素(coumarin)及其衍生物；青色素染料[cyaninedyes]Cy3和Cy5]共价偶联的核苷单体dNTP。从而合成带有各种信号标记并被扩增的cDNA靶基因。来自不同的组织标本的靶基因扩增选用不同发射光波长的信号标记物。然后将带有标记物来自不同细胞组织标本的cDNA靶杂交到基因芯片上固定的探针片段上。杂交结果将被检测并比较用来与相应的疾病相关联。目前的荧光标记大多费时而且过程烦琐，还存在着灵敏度不足和形成靶-探针的二级结构的问题。
本发明的目的 本发明的目的之一，是为基因芯片产品提供一套大幅度提升检测灵敏度，经济实用性和可实现自动化运行的信号放大标记技术及试剂盒。
本发明与背景技术相比所产生的积极效果 本发明中所提供的方法不仅极大提高了基因芯片检测灵敏度，处理时效，降低成本，同时还使非专业技术人员经过简短操作培训或指导，可以利用这种高度自动化的设备进行高水平和高效率的基因分析。这一切都为基因芯片的普及化应用提供了技术推动力。另外，作为一般性方法，无论是被应用于固相[如基片式基因芯片等]还是液相溶液条件下[微流体芯片，毛细管电泳芯片，实验室芯片等]，该信号放大技术，有着PCR[聚合酶链式反应，基因扩增技术]技术和用于其他基因检测中所用到的信号放大技术所不具备的诸多优点。由于该技术不依赖基因扩增，依靠简单的生物、化学或电化学标记，所以，该技术可以准确定量、不易造成污染、可以避免假阳性检测结果、试剂盒成本低廉、容易实现自动化等优点，而且样品制备简易。这一切是PCR技术所达不到的。因此，它可以作为一般性的信号放大方法应用在其他形式的核酸检测中。归纳起来，本发明所带来的有益效果有如下几个方面1、为一般的基因芯片技术产品提供了超灵敏检测的技术基础，同时由此信号放大技术支持的处理仪器也可以产生很高的信噪比，满足科研和临床诊断等实用领域对超灵敏基因芯片检测技术的需求，有利于推动基因芯片技术在临床诊断、工商检疫和环境检测等方面的普及应用，
2、本发明所提供的信号放大技术有利于实现自动化，使处理系统的集成化程度进一步提高，系统处理过程进一步简化，使专业技术人员的处理效率提高，同时也降低了对非专业技术人员的专业技术要求，提高了基因芯片使用中结果的重复性和稳定性，3、本发明中使用双探针也有利于提高基因芯片的检测的特异性，4、本发明也为降低基因芯片处理系统的成本及运行成本提供了技术支持，有利于基因芯片的普及应用。
本发明的技术原理 本发明提出一种基因芯片双探针放大标记技术，这种基因芯片由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的探针组成，用于检测样品中的生物或化学靶物质。基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成(1)无机片状或平板状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In2O3:Sn]、InAs、SnO2:F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，Cdln2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，以及多孔板模式，如微孔板、微滴板，(2)单质类铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅等非金属，(3)有机物类各种有机分子及其由此制成的自组装单分子膜或自组装多分子膜，(4)高分子类尼龙膜、塑料、橡胶、树脂，硝酸纤维素膜。
基底的结构可以是但不限于如下种类(1)薄片/平板式如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、(2)多孔板式如微孔板，微滴板式等，(3)电极式在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，(4)微管式由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，本发明所说的基因芯片上用来检测的探针或靶可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合或下面种类的某种成分，提取物(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[简称mRNA]、转录RNA[简称tRNA]等，(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脱氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，简称ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，
(4)核酸结构相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，简称PNA]，(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等。
本发明在基因芯片处理技术中采用高荷信号载体(高分子荧光微球或含有大量荧光染料、半导体纳米晶量子点、电致发光分子等的高分子颗粒，通过合成技术将大量信号分子聚合为一体的各种形式的巨型信号分子，硅氧光学磁珠[silica beads]，胶体金[或纳米金颗粒，colloidal gold nanoparticles]，或通过任何其他手段将荧光染料，非荧光染料，半导体量子点、电致发光、化学发光或生物发光物质信号分子等固定于微粒的表面或包埋于其内部等多种形式的高荷信号载体)作为标记物进行分子信号放大。
本发明所要介绍的基因芯片信号放大标记技术，是以各种形式的高荷信号载体或信号体应用于标记各种形式的基因芯片探针、靶或探针-靶杂交体。
这里所说的基因芯片包括但不限于如下类型基因芯片[包括各种DNA芯片，如玻璃基因芯片，膜芯片，实验室芯片，微流体芯片等]、以电化学原理或生物电子学原理为基础的各种生物传感器等。
本发明所使用基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性亲合反应结合体或杂交体进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测。以玻璃、硅片、尼龙膜等为材质的基因芯片、蛋白芯片、免疫芯片多采取这种模式；(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillaryelectrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokineticchromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillarychromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillaryelectrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueous capillaryelectrophoresis(NACE)]等，(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electrondonor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electron acceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对(Mismatches)存在的双链核酸(nucleic acids duplexes)分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察，如在基因突变、基因多态性、基因测序、基因表达谱研究、疾病机理分析和疾病诊断等方面的应用，(6)将发生在核酸分子上或由具有氧化还原性质的物质(包括但不限于，具有氧化还原性质的金属络合物以及由金属络合物或金属络合物的衍生物为单体聚合而成的聚合物、荧光分子、核酸嵌入剂等)所发生的电子或电荷转移反应或电子流转换成其他可检测或可考察形式的检测技术，如通过电致发光[Electroluminescence]原理，利用电致发光分子将电子流转换为光信号所进行的检测，(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。如摩托罗拉公司的eSensor Chips。
(8)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gelpermeation chromatography]，MCC[metal chelate chromatography]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellarelectrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillary electrochromatography(CEC)]等。
这里所说基因芯片的高荷信号载体[HSC]包括但不限于如下类型，以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是量子点微球[QD-tagged Microbeads]、高聚物荧光微球或高分子荧光微球[polymer microspheres]或胶体微珠[latex beads]、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、胶体发光半导体纳米晶量子点[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystalquantum dots]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高分子或树形分子[star dendrimers，dendrimeric stars or dendrimers]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微小颗粒或量子点[如Chaperoninmediated semiconductor nanoparticles.Chaperonin中以Chaperonin GroEL蛋白和T.th cpn蛋白包裹效果最佳]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconoeene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloids functionalized with amidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合。其表面修饰有可以与下面通式(I)化合物中的探针接头A-特异性反应的功能团或作用对A’-。
这里特别提一下量子点微球[QD-tagged Microbeads，或QD-tagged Polymeric Microspheres，QD-Beads]。这是一种将量子点包埋在高分子微球中的一种HSC。由于QD可以被大量地包埋到高分子微球中，因而也是一种信号极强的HSC。鉴于一方面QD在发光波长上可以通过半导体纳米晶粒径的调节轻易地实现调节，另一方面高分子微球在包埋QD方面可以根据包埋的比例不同改变量子点微球的光信号强度水平，因此，量子点微球[QD-Beads]在荧光发射的波长与强度方面可以很理想地实现多元化和层次化。另外，在有利的制备条件下，量子点微球可以达到高度的均一，在电泳等1 方面有着极为有价值的应用意义。
本发明所要介绍的信号放大技术，是一种双探针基因芯片信号放大标记技术，其特征是，双探针由捕获探针[Capture Probe]和标记探针[Labeling Probe]组成，捕获探针固定于基因芯片固相表面，构成基因芯片微点阵，而标记探针是由高荷信号载体以及一个或更多固定于其表面的、或与高荷信号载体进行共价键或非共价键偶联的可以与靶基因上的一个或不止一个位点的序列进行互补杂交的特异性核酸序列构成，游离存在于标记溶液中，二者都分别拥有与待测靶基因的不同位点的特异性序列互补配对的核酸序列。
这种双探针基因芯片信号放大技术，其标记反应模式可以是，但不限于如下通式所描述的几种情景(1)单一样本来源的靶基因与标记探针优先杂交，在杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，成为标记靶基因，再与基因芯片上的捕获探针特异性杂交，同样在捕获探针与靶基因所形成的杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，形成双探针杂交标记的靶基因，(2)两种或两种以上不同样本来源的靶基因分别与不同特性的标记探针优先杂交，从而使不同来源的靶基因各自被特异性的标记探针所定义，在杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，成为标记靶基因，再与基因芯片上的捕获探针特异性杂交，同样在捕获探针与靶基因所形成的杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，形成双探针杂交标记的靶基因，(3)单一来源的靶基因与捕获探针和标记探针同时进行杂交过程，之后，进行或未进行杂交双链的链间锁定过程以强化标记和杂交双链的连接强度，标记探针的结构可以用通式(I)表示，通式(I)F(-L-XNA)n’或F(-XNA)n’
用以核酸双链链间交联或锁定的化合物以X表示，可以分别是如下情况之一或不同类型化合物的组合使用，n是从零到无穷大的自然数0，1，2，3...
其中，X-是与双链核酸通过静电吸引力、次键力[如范德华力、氢键等]、与双螺旋结构中的大沟或小沟的亲和力[Groove binders]、嵌入双链碱基对的亲和力[intercalators]、与双螺旋结构形成三螺旋结构或四螺旋结构等方式相结合的功能团，与核酸双螺旋结构通过化学反应形成共价键结合的功能团或分子，可以特异性识别核酸双链结构并与之结合的生物分子，可与核酸双链络合或结合的各种生物或化学分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物为结构基础或特征的各种衍生物和生物或化学修饰后所形成的化合物X-的结构特征根据其与为杂交单链核酸或与已经互补杂交的核酸双螺旋结构发生相互作用性质可以分为如下几种类型；1.静电吸引力、次键力[如范德华力、氢键等]，与核酸双螺旋结构中的大沟或小沟的亲和力[Groovebinders]。属于这种情况的X-可以是，但不限于如下几种化合物(1)以双螺旋大沟[major grooves]为作用机理的嵌入剂放射菌素类，如7-氨基-放射菌素D[7-amino-Actinomycin D]；(2)与双螺旋小沟[minor grooves]形成络合物的咔唑类[如3，6-carbazole，2，7-carbazole]和二苯基呋喃二铵类[diphenylfuran diamindine]，聚胺类[polyamines]DNA嵌入剂，吲醌类嵌入剂[6H-indoloquinolinecore]，烷基氨基烷基链[alkylaminoalkyl chain，DNA小沟嵌入剂]，2.可以嵌入杂交核酸双螺旋碱基对的亲和力[intercalators]。属于这种情况的X-可以是(1)在一定条件下，可以形成链间共价交联的一类化合物，如补骨脂素(Psoralen，relatively weak(Kd10-4M))、异补骨脂素以及它们的任何衍生物形式，如4’-羟甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trioxalen，简写HMT)、4’-胺甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(4’-aminomethyl-4，5’，8-trioxalen，简写AMT)、三甲基补骨脂素(trimethylpsoralen，简写TMP)、8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen，缩写为8-MOP)、4，7，4’-和4，7，5’-三甲基异补骨脂素(4，7，4′-and 4，7，5′-trimethylallopsoralen)以及补骨脂素本身。光激发嵌入剂[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，顺氯氨铂[cisplatin]，兼具DNA光损伤性质的嵌入剂吲哚基喹啉正离子盐类或喹啉衍生物正离子盐类[indolo[2，3-b]-quinolizinium bromide]；(2)作为双链嵌入剂的EDTA过渡金属络合物类[如methinidiumpropyl EDTA Fe(II)]，2，7-diazapyrene(DAP)，DAPI[4’-6-diamidino-2-phyenylindole]，N-甲基化正离子[N-methylated cations DAP+andDAP2+]，吖啶类化合物{Acridine orange[3，6-bis(dimethylamino)acridine，HCl]}，双齿状吖啶类嵌入剂[bis-dentate acridine intercalators]、氨基氮蒽或氨基吖啶[9-aminoacridine(9AA)]，碘基或碘代吖啶类[2-iodine-125-iodoacridine]；(3)可切断DNA链结构的嵌入剂亚德里亚霉素或阿霉素[Adriamycin，或Doxorubicin]，elsamicin，Nogalamycin，Sanguinarine，Cherethyrine，anthracyclinedrug，leinamycin，Echinomycine，正定霉素或道诺霉素类[Daunomycin]，[Rebeccamycin]；(4)兼具核酸碱基嵌入功能和双螺旋沟槽嵌入功能的偏端霉素类化合物[distamycin]和纺锤菌素类化合物[netropsin]以及Hoechst 33258和Hoechst33342等；(5)以次键力为主与双螺旋结构中的堆积碱基相互作用的亚甲基蓝[methylene blue(MB，MB+)，溴乙非啶或溴化二氨乙苯啡啶[ethidiumbromide]和二溴乙锭正离子[diethdium cathion]，3.与双螺旋结构形成三螺旋结构或四螺旋结构等方式相结合的功能团，与核酸双螺旋结构通过化学反应形成共价键结合的功能团或分子，可以特异性识别核酸双链结构并与之结合的生物分子，可与核酸双链络合或结合的各种生物或化学分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物为结构基础或特征的各种衍生物(1)所有可以嵌入核酸双链结构或核酸双链的大沟或小沟中的嵌入物、多聚嵌入物、线性或环状嵌入物等，4.可与RNA形成各种络合物的核仁素类[如Nucleolin RBD12]，5.可以在双螺旋结构中的多个位点进行嵌入的多重嵌入剂，比如将棘皮霉素类[Echinomycine，DNA双重嵌入剂]通过共价键偶联起来，或串联起来，可以形成四重嵌入的四重嵌入剂；6.重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐[berenil]，细胞毒素类[如cytotoxin NLCQ-1]，三骨菌素[triostin]，黄连素类[如protoberberine-8]，，口腔M[Gilvocarcin M]，呋喃萘基吡喃酮类[furonaphthopyrone]，卟啉或金属卟啉类化合物[porphyrins or metalloporphyrins]，咔啉类化合物[如beta-carbolines]，原黄素[proflavin(Acr-NH2)]，3，7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride]，苯基巯基吡喃[benzothiopyranoindazole]，[水溶性]亚丙基碘化物[propidium iodide]，7.以芳香环结构堆积为特征的线状多聚DNA嵌入物[the stacked aedamer core，具有两个或若干个1，4，5，8-四羧酸二酰亚胺(1，4，5，8-tetracarboxylic diimide)等特征结构单元多聚嵌入物]，8.可以产生电化学信号的嵌入物二茂铁基萘二酰亚胺类线状嵌入剂[threading ferrocenyl naphthalinediimide]；9.蒽类[anthryl compands如AMAC[9-氨基-6-氯-2-甲氧基哑啶(9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)]，anthracycline，APAC，N-Et-AMAC等]，蒽醌类[anthraquinones]，萘二酰亚胺类嵌入剂[naphthalene diimide intercalators]，菲离子类嵌入剂[phenanthridinium intercalators]，10.金属类嵌入剂，如八面体DNA铑嵌入剂[rhodium intercalator，bis(2-2′bipyridyl)chrysene quinone diimine，D-[Rh[(R，R)-Me 2 trien]phi]3+，Ru(NH2)63+]，有手性络合物结构的金属钌嵌入剂[ruthenium intercalators，[Ru(phen)2dppz]2+(phen＝1，10-phenantroline；dppz＝dipyrido[3，2-a2′，3′-c]phenazine)]，terpyridine platinum compound(TPH)，mitoxantrone，镧系金属化合物DNA嵌入剂[lanthanide]，二吡啶基(乙二胺)铂盐或三吡啶基铂盐类[bipyridyl(ethylenediamine)Pt(II)2+，4-picoline-2，2’6’，2”-terpyridine-platinum]，11.可改变双螺旋沟槽结构的萘二酰亚胺类化合物[双嵌入剂，如naphthalene diimides，N，N’-disubstituted naphthalene diimide derivatives，用多肽链作为嵌入双螺旋小沟的连接臂的萘四羧酸二酰亚胺双嵌入剂(1，4，5，8-Naphthalene Tetracarboxylic Diimide Bis-Intercalator with theLinker(-Ala)3-Lys in the Minor Groove)，用胺基烷基将DNA嵌入功能团线性连接起来所形成的双嵌入剂，三嵌入剂，多聚嵌入剂和有环双线状嵌入剂等]，12.荷苞牡丹碱类[dicentrine]，三环大那霉素类[tricyclic dynemicin A]，硝基胺类[nitracrine，亲电子性DNA嵌入剂]，环磷酰胺类[cyclophosphamide]，amsacrine，丹参酮类[如Dihydrotanshinone，I]，octahydroxanthene，吲唑类[indazoles，如benzothiopyranoindazole DNA嵌入剂]，咪唑类[imidazole]，N-[4-(9-吖啶基氨基)-3-甲氧基-苯基]甲烷-磺胺类化合物[N-[4-(9-acrydinylamino)-3-methoxy-phenyl]methane-sulphonamide，m-AMSA]，大环内酰胺类[macrocyclic lactam]，喹啉衍生物类嵌入剂{如indolo[2，3-b]quinolines，6H-indoloquinoline core，quinoxalines}，Amsacrine，(夹)氧杂蒽类[Xanthenes，如1，8-二氧代-9-(o-硝基苯基)-1，2，3，4，5，6，7，8八氢氧杂蒽(1，8-dioxo-9-(o-nitrophenyl)-1，2，3，4，5，6，7，8-octahydroxanthene)]，luzopeptin，甘菊环类[6a，7-diazanaphth[3，2，1-cd]azulene和7H-1，7-diazaindoleno[1，2e]azulene system]，Ditercalinium，4，6-diamidino-2-phenyline[DAPI]，戊烷脒类[pentamidine]，13.Pixantrone，基于吲哚结构的玫瑰树碱类[indole-based intercalator ellipticine]，奎吖因类[quinacrine]，重氮化合物类[4，9-diazapyrenium]，雌甾二醇类[estradiol]，双苯基酰亚胺类[bisbenzimide]，噻唑类[如thiazole orange]，14.光活性生物素或光生物素[photoactivable biotin，photobiotin]、光生物素与生物分子或化学分子的偶联体、及光生物素的衍生物，15.所有可以对核酸进行染色的染料分子，如荧光染料bisbenzimide H fluorochrome[TriHCl]，色霉素[chromomycin]A3，荧光性嵌入剂[如TOTO，YOYO，SYBR Green]，16.所有可以与基因芯片上的已互补杂交的核酸双螺旋结构形成三重(倍)[triplex]螺旋或四重(倍)[quadruplex]螺旋结构的化合物或生物分子或生物分子结构类似物以及此结构与其他分子共价偶联所形成的复杂分子结构，如PNA[peptide nucleic acids]，寡聚核苷酸，多肽[如[N-MeCys3，N-MeCys7]TANDEM]等；17.可与核酸双链发生化学反应或光化学反应从而形成共价键连接的功能团或分子，如叠氮类化合物，结构中含有苯甲酮功能团的化合物及其衍生物。可以与核酸探针或靶基因发生共价交联的各种化学交联剂或化学反应功能团如可以通过与靶基因上的羟基发生缩水反应的碳二亚胺，或光化学反应活性的交联剂，如芳香基叠氮化合物[aryl azides，如N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide[PEAS]等]、氟代芳香基叠氮化合物[fluorinated arylazides]，苯甲酮类光反应试剂[benzophenone-based photoreactive reagents，如苯甲酮马来酰亚胺[benzophenone maleimide]]等；18.可以序列特异性地或非序列特异性地识别核酸双链结构并与之结合或以双链核酸的双螺旋结构为底物的蛋白质或酶等生物分子，如HMGB蛋白，可与经顺氯氨铂修饰的dsDNA结合的NHP6A蛋白，参与DNA复制的酶、凝血酶[thrombin]、RNA转录的酶丝裂霉素[Mitomycin C]、可以与核酸双螺旋结构的双链间形成共价桥形键的博来霉素或争光霉素类[Bleomycin]、双链核酸抗体、双链核酸的特异性结合酶，DNA聚合酶或RNA聚合酶，
19.可以与待测靶基因或基因芯片上探针核酸分子的某个或某些特异性序列进行特异性互补并结合形成互补双链结构的寡聚核苷酸分子，反义核酸[anti-sense nucleic acid sequences]序列等。该类化合物可以同时适用于杂交前标记和杂交后标记两种方案。
20.上述各种嵌入剂或结合物组合或通过共价键结合起来的分子结构，或通过化学修饰从而实现在与核酸探针、靶或探针-靶杂交双链发生相互作用并形成共价键连接或交联的上述化合物的衍生物，或单独与多肽、线性或链状生物或化学合成高分子偶联形成的高级嵌入剂或核酸结合分子。
21.具有氧化还原[redox]性质，可以发生电子授受反应[Electron Donor-Acceptor Reaction]或电子转移反应[Electron-Transfer Reaction]的核酸结合物以及以这些化合物为单体聚合而成的聚合物和低聚物、寡聚物，如[a]可以嵌入核酸双链中的荧光分子有但不限于，亚甲基蓝[Methylene Blue，MB+]和Hoechst33258等荧光分子等，或[b]金属络合物，如钌金属络合物[Rutheniumtris(2，2’-bipyridine)]等，或[c]通过共价键连接或非共价键结合与上述任何一种核酸嵌入剂发生共价交联或非共价键结合的具有氧化还原性质的高荷信号载体[HSC]，包括但不限于，多聚二茂铁基团[polyferrocenyl]、多聚二茂锆基团、多聚二茂钌基团等多聚二茂金属类物质。
-L-可以是但不限于如下各种结构或分子(1)溶剂相容性连接臂，即当溶剂为疏水体系时，连接臂亦为疏水连接臂；当溶剂为亲水体系时，连接臂亦为亲水连接臂，可以是PEG、合成多肽等，长度不限，(2)分子导线[molecular wires，如双链DNA分子，亲水性连接臂，珠链型富勒烯线型聚合物(富勒烯被导入有机高分子主链的珠链型高分子)或将富勒烯[巴基球，fullerene]用R基连接起来的巴基球项链等]，(3)分子绝缘体[molecular insulators，如疏水性连接臂，长链烷烃等]，(4)结合有分子磁体的连接臂等，(5)在化学或光学等因素作用下，分子链可以断链的连接臂等，如双硫键[-SS-]等。
F表示以各种微小颗粒形式存在的高负荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是高聚物或共聚物荧光微球、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半导体等无机物的量子点[quantum dots]、半导体等无机物纳米晶[nanocrystal particles]、树枝状高聚物纳米球[dendrimers]、星形树枝状高聚物纳米球[dendrimeric stars]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescentmolecules]、多聚二茂金属共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂铁共聚物[polyferroceneblock copolymers，PFC]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合，其表面修饰有可以与通式(I)化合物中的探针分子接头A-特异性反应的功能团或作用对A’-。
本发明还在基因芯片的杂交或探针-靶特异性结合过程，标记，洗脱等过程中全面引入了程序化交变电磁场作用，用于加快上述过程的效率，缩短过程所需时间。
本发明所涉及技术术语的定义本发明以下术语与Chenchik等人的美国专利[US.Pat 6,489,159]相同缩氨酸[peptide]、低聚肽[oligopeptide]、多肽[polypeptide]、核酸[nucleic acid]、核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]、DNA、寡核苷酸[oligonucleotide]、多聚核苷酸[polynucleotide]等。
高荷信号载体[HSC]本发明如下定义 靶和探针、高聚物荧光微球或高分子荧光微球[polymer microspheres]或胶体微珠[latex beads]、量子点微球[QD-tagged Microbeads]、硅氧磁珠[silica beads]、胶体发光半导体纳米晶量子点[colloidal fluorescent semiconductor nanocrystal quantum dots]等术语采用被目前普遍认可的命名标准。
实例一 本实施例用于基因芯片在捕获探针和靶基因杂交之前进行标记的实施例，当X-选用补骨脂素[Psoralen]及其衍生物时的技术解决方案[包括基因芯片杂交室、HCL仪和SPR-CCD信号检测与数据处理系统]，可以参见在先专利申请[国际专利申请基因芯片分子探针及相关技术。国际申请号，PCT/CN02/00887]。这些方法对于以玻璃、石英、硅、塑料和膜等薄片式基因芯片是适用的。
由于本发明中的捕获探针就是基因芯片基片上点制微点针用的基因探针，目前属于十分成熟的技术工艺，因此，此处不再述及捕获探针的制备。本发明将着重阐述标记探针的制备。
标记探针的制备分三部分与靶基因上某位点的碱基序列可以特异性互补核酸探针的设计、高荷信号载体的选取以及二者的共价键或非共价键偶联。
(1)荧光微球的选取通式(I)中的F-选择高分子荧光微球，如聚苯乙烯荧光微球等。可以采购美国Molecular Probes公司，Duke公司或Bang’s Laboratories等公司的产品。关于荧光微球的激发光/发射光波长，表面的化学特性等方面的因素考虑及其解决方案请参阅本人的中国发明专利申请，其申请号是01142654.3。作为最佳实施例，可以选择与市场上基因芯片扫描仪激发光/发射光波长相吻合的，激发光波长在488纳米、633纳米的聚苯乙烯荧光微球。
(2)荧光微球与核酸分子的共价键或非共价键偶联[1]选择Molecular Probes Inc公司的表面羧基修饰的荧光微球，[2]用DNA合成仪合成3’-末端或5’-末端带氨基的寡聚核苷酸，[3]用水溶性碳二亚胺[EDAC]将前二者通过共价键偶联起来，形成与某靶基因可以互补杂交的标记探针。
(3)用(1)和(2)所述的方法，制备出与不同靶基因的特异性位点分别互补配对并杂交的标记探针。
(4)杂交杂交时将不同标记探针与靶基因溶液混合在一起，与基因芯片上的捕获探针进行同时杂交。杂交过程参见Hames，B.D.，和Higgins，S.J等人的《核酸杂交，一种实用方法》等。
实例二 本实例其他部分与实例一相同，只是通式(I)中的F选择量子点[QDs]、量子点微球[QD-taggedMicrobeads，或QD-tagged Polymeric Microspheres，QD-Beads(这是一种将量子点包埋在高分子微球中的一种HSC。由于QD可以被大量地包埋到高分子微球中，因而也是一种信号极强的HSC。鉴于一方面QD在发光波长上可以通过半导体纳米晶粒径的调节轻易地实现调节，另一方面高分子微球在包埋QD方面可以根据包埋的比例不同改变量子点微球的光信号强度水平，因此，量子点微球[QD-Beads]在荧光发射的波长与强度方面可以很理想地实现多元化和层次化。另外，在有利的制备条件下，量子点微球可以达到高度的均一，在电泳等方面有着极为有价值的应用意义)]、荧光树枝状高分子[dendrimers，简称DD]、星形树枝状高聚物[dendrimeric stars，或star dendrimers，以下简称SD]、分子磁体[molecular magnets]电致发光分子[electroluminescent molecules]、多聚二茂金属共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如多聚二茂铁共聚物[polyferrocene block copolymers，PFC]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]共聚物微球或纳米球等。
高荷信号载体SD的制备，可以选用Ronald C Hedden等人的方法，先制成聚PAMAM[poly(amidoamine)]SD核。在此SD核中生长出金属[如金，铂，钯等]或半导体[如CdS纳米晶，通常控制在2-10纳米]。在PAMAMSD核表面有大量的胺基，在加入可以接上PEG[即聚乙二醇，poly(ethylene glycol)，5,000g/mol]臂的同时，按照一定的比例[MAL-PEG-NHS和PEG-NHS的比例为，1∶10]掺入马来酰亚胺-PEG-N-羟基-琥珀酰亚胺酯[Maleimide PEG NHS ester，简写MAL-PEG-NHS，有市售。Apollo Scientific Ltd，http//www.apolloscientific.co.uk/otherProducts_Lifesciences_PEGcross.htm]，从而制成马来酰亚胺基修饰的SD[SD(PEG-MAL)n]，作为通式(I)中的F。
合成3’-末端或5’-末端为巯基修饰的与某一靶基因的特异性位点序列互补的核酸探针，与SD(PEG-MAL)n在水溶液环境下进行共价键偶联。偶联过程与杂交过程参见实例一的相关部分以及本人的中国发明专利申请微阵列信号放大方法，申请号03129124.4。
实例三 当通式(I)中的X-选用顺氯氨铂[cisplatin，即(cis-diamminedichloroplatinum(II))]及其衍生物[无须光化学交联]，或光激发嵌入剂钌络合物[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，或烷基化物氮芥[即二氯甲基二乙胺[mechlorethamine(ME)]，或称nitrogenmustard，无须光激发交联]等。以钌络合物为X-为例，须合成钌络合物琥珀酸酯作为通式(I)X-L-A化合物的体现。为此，可以采用Dimitri Ossipov等人的合成技术)固相合成技术合成钌络合物琥珀酸酯[succinate 3′-[Ru(tpy)(dppz)Cl]+。其中，琥珀酸酯基作为与高荷信号载体表面大量修饰的伯胺基[-NH2，A’-]可以特异性反应对中反应基团[A-]进行特异性共价键标记反应。
其他部分技术解决方案可参见在先专利申请[国际专利申请基因芯片分子探针及相关技术]。
实例四 将实例一中的氨基末端的核酸标记探针用生物素末端的核酸标记探针来替代。而购买链霉亲合素[streptavidin]表面包被的聚苯乙烯荧光微球代替表面羧基修饰的聚苯乙烯荧光微球。其他条件相同。
实例五 本实施例为双探针双色法基因芯片杂交信号放大标记。双色法标记的目的主要是为了用一张基因芯片同时检测来自不同细胞或组织样品来源的靶基因，并在同一张基因芯片上通过竞争性杂交进行比较，根据最终所显示出来的颜色来判断两种来源的靶基因丰度或含量或表达比例等相对值。这种方法尤其在分析基因差异表达谱中经常使用。目前，通常采用分别被Cy3和Cy5标记的碱基在对样品DNA或RNA PCR扩增时掺入到PCR产品中，并被混合在一起用来标记基因芯片。本发明中所揭示的HSC信号放大技术同样可以用双探针双色法标记来自不同来源DNA或RNA样品中靶基因及其表达比例，或同一来源的基因在不同条件下的不同的表达比例，并在基因芯片上进行检测。
标记探针合成步骤[该步骤的目的是合成标记探针杂交标记了的来源不同的靶基因。等效于目前基因芯片常用的用来检测差异表达基因时用于与基因芯片上的探针微阵列杂交的靶基因。即“标记探针+靶基因＝标记靶基因”](1)先合成如实例一所述的与各种靶基因特异性位点互补配对的末端氨基修饰的DNA，混合，用等量的上述DNA溶液分别与不同荧光发射波长[激发波长分别在488nm和633nm]的表面羧基修饰的聚苯乙烯微球在在水溶性碳二亚胺作用下进行共价键偶联，形成标记探针。
(2)两种不同发射光波长的标记探针分别与来自不同样本的DNA或RNA靶基因进行杂交，并用补骨脂素在紫外光激发下使杂交双链发生共价键交联，分别形成两种不同的标记靶基因。将等量的上述两个溶液[各30微升]混合并与基因芯片上的捕获探针进行杂交。杂交缓冲液为(5×SSC，6×Denhardt’s溶液，60mM Tris HCl pH7.6，0.12％ sarkosyl，48％ formamide；filter sterilised)。在42-47摄氏度2-4小时。
借助本人的国际专利申请[基因芯片分子探针及相关技术。国际申请号，PCT/CN02/00887]中的HCL仪，杂交过程如下预杂交(1)将基因芯片杂交室预冷到4摄氏度，将50微升的杂交缓冲液加入其中，将微量杂交缓冲液从基因芯片杂交室正面的小孔加入，用小橡皮塞塞住以防止缓冲液挥发，保持杂交过程的湿度，(2)在47摄氏度温浴2-4小时，(3)用至少250微升洗脱液在室温下洗涤基因芯片15-30秒，(4)导入干燥空气1-2分钟，将基因芯片杂交室凉干。
杂交(1)混合两种单链cDNA标记探针过程如下33μl ss cDNA标记靶基因(488nm)，33μl ss cDNA标记靶基因(633nm)，4μl polyA DNA，4μl人类Cot1 DNA和7.0μl 3M乙酸钠pH5.2，218μl，绝对乙醇≈293μl，(2)沉淀ss cDNAs，polyA和Cot1 DNA，-70℃ 20分钟，(3)加入基因芯片杂交室，在47℃下温浴12-24小时。室温下洗脱，凉干，(4)用激光共聚焦或CCD检测仪，对上述两个波长的荧光进行检测。
实例六 其他过程如实例五所述。本实施例用不同发射荧光波长的QD、SD等分别制作标记探针并用来与来自不同样本的DNA或RNA样本进行杂交。本实施例用半导体量子点纳米晶代替聚苯乙烯荧光微球。
实例七 本实施例为不同种类不同大小的高荷信号载体[HSC]对基因芯片杂交前或杂交后进行的联合标记。由于本发明所介绍的信号放大技术是依靠不同大小和种类的HSC可以携带不同量的信号分子进行信号放大的，尺寸越大的HSC可以携带的信号分子越多，在信号检测中可以发出越强的信号，其信号放大能力就越强。但是，随着HSC尺寸的增大，它们在被标记到基因芯片上之后所占据的空间就会越大。以下是由美国Molecular Probes公司提供的荧光高分子微球的尺寸和所携带的信号分子[荧光素当量]之间的关系*。
荧光微球直径[微米] 每个荧光微球的荧光素当量
0.02 1.8×1020.04 3.5×1020.1 7.4×1030.2 1.1×1050.5 2.0×1061.0 1.3×1072.0 3.1×107101.1×1010153.7×1010*注本表摘自《Handbook of Fluorescent Probes and Research Products》第九版，第177页。by RichardP.Haugland。
根据这些数据可以计算出每种尺寸的荧光微球可以占据的基因芯片空间面积，并继而计算出通过使用该尺寸的荧光微球在基因芯片上的基因点的直径为200微米[所占据基因芯片面积为104π微米2]时可以达到的理论灵敏度检测线性范围[见下表]。表中还附带了一些关于胶体半导体[CdSe]纳米晶量子点[QDs]的直径尺寸[一般在2-5纳米。此处取值4纳米。根据报道其信号强度是一般荧光信号分子，如荧光素强度的20倍]。借助于激光共聚焦基因芯片检测仪[根据Affymetrix公司的介绍，他们依靠此技术检测灵敏度下限为30万个分子。即只有在待测标本中有30万个DNA分子时，采可以检测得到]所能达到的灵敏度下限[可检测分子数]。
每个荧光微球荧光微球在基因芯片 每个基因点上可以标记的最大荧光激光共聚焦基因芯片扫描的荧光素当量上占据的面积[微米2] 微球数目[灵敏度线性检测上限] 仪可以达到的灵敏度下限1.8×1021×10-4π 1×10816673.5×1024×10-4π 2.5×1078577.4×10325×10-4π4×106401.1×1051×10-2π 1×10632.0×1060.0625π 1.6×1050.151.3×1070.25π 4×104-3.1×107π 1×104-1.1×101025π 4×102-3.7×101056.25π 1.7×102-QD的荧光素 QD在基因芯片上占 每个基因点上可以标记的最大QD 激光共聚焦基因芯片扫描当量 据的面积[微米2] 数目[灵敏度线性检测上限] 仪可以达到的灵敏度下限20 1.6×10-5π 6.25×1081.5×104从上表可以看出在灵敏度提高的同时，检测的线性范围数量级大致不变，而线性检测的上限开始下移。因此，在灵敏度下限和上限之间存在着一定的矛盾。随着灵敏度提高，灵敏度的检测范围的上限会下降。
为了克服这个矛盾，本实施例采用不同信号放大能力的HSC联合使用的技术。即，采用不同尺寸[即不同信号放大能力]的同一种颜色或不同颜色的高分子荧光微球，或者较大尺寸的荧光高分子微球和QD的组合使用。选材时，尽量力求不同品种、规格或颜色的HSC的灵敏度上限和下限的衔接，以确保低信号放大能力的HSC的高的线性检测上限与高信号放大能力HSC的低的线性检测下线衔接起来，从而优势互补。比如，采用200纳米直径的高分子荧光微球[灵敏度线性检测范围为3～106个分子]]与4纳米直径的半导体纳米晶QD[灵敏度线性检测范围为1.5×104～6.25×108个分子]联合使用，可以将实际测量的线性范围扩大到3～6.25×108个分子。当然，也可以选择和20纳米直径的高分子荧光微球联合使用，从而将线性检测范围扩展到3～1×108个分子。
不同粒径、不同发射光颜色[不同的荧光波长]和不同表面化学功能团修饰[用以连接不同的连接臂]的荧光高分子微球可直接购买[Molecular Probes，Merck，Bangs Laboratories公司.，Brookhaven仪器有限公司或Duke科学公司等]。
QD的表面化学修饰和共价偶联技术可以参照Bawendi等人的美国专利US.Pat 6,306,610，2001年10月23日。
HSC诸如不同发光波长和信号强度的量子点微球、高分子微球、量子点等都是非常好的选材。
权利要求
1.一种双探针基因芯片信号放大标记技术，其特征是，双探针由捕获探针[Capture Probe]和标记探针[Labeling Probe]组成，捕获探针固定于基因芯片固相表面，构成基因芯片微点阵，而标记探针是由高荷信号载体以及一个或更多固定于其表面的、可以与靶基因上的一个或不止一个位点的序列进行互补杂交的特异性核酸序列构成，游离存在于标记溶液中，二者都分别拥有与待测靶基因的不同位点的特异性序列互补配对的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，是由基底及其表面的镀层或涂层和固定在基底[缩写为S]或镀层[缩写为C]表面的不少于两个阵列式排列的捕获探针组成，用于检测样品中的基因靶基因，基底和/或镀层或涂层的材料可以由但不限于如下材料中任意一种或一种以上不同材料组合制成(1)无机物片状材料类如玻璃、石英、云母，透明导电材料如透明导电氧化物类[TCO]，如氧化铟锡[indium tin oxide，ITO，或写为In2O3:Sn]、SnO2:F、砷化镓[GaAs]、氧化镁等镀层，氧化锡[tin oxide，SnO]，ZnO，CdO，CdIn2O4，Cd2SnO4，Zn2SnO4和In2O3-ZnO等，以及碳/陶复合导电陶瓷，各种半导体材料等，(2)单质类铂、金、银、铝、铬[Au，Ag，Pt，Cu，Rh，Pd，Al，Cr]等金属以及硅非金属等，(3)有机物类各种有机分子及其由此制成的自组装单分子膜或自组装多分子膜，(4)高分子类尼龙膜、醋酸纤维素膜、各种塑料、橡胶、树脂，基底的结构可以是但不限于如下种类(1)薄片式如玻璃片、硅片、尼龙膜、塑料片、微孔板，微滴板式等，(2)电极式在薄片式基因芯片上以一定规律排列而成的各种电极阵列，如在半导体、绝缘体等基底上制成的铂电极、金电极等，(3)微管式由毛细管或有毛细管管状内腔结构特点的其它材料，按预先设定的位置对应规则排列而成的各种矩阵式毛细管基因芯片[二维平面排列]、线形毛细管基因芯片[一维线形排列]、以及在基片式结构中制作出的各种不少于一个微管道式空腔结构的矩阵式并行排列[即微流体电泳芯片等]，(4)微粒式以微小颗粒为固相载体，生物分子或化学分子被固定在其表面，通过微小颗粒的大小、[发光]颜色、表面电势、表面电荷密度等性质元素进行分类组合从而产生出大量不同组合的微粒，分别用某一特定组参数的组合[某一尺寸和某发光波长等的特殊组合---编码]的微小颗粒作为某生物或化学分子的载体，从而可以用大量不同且特殊编码微小颗粒制成基因芯片，
3.根据权利要求1所述的捕获探针、标记探针或靶基因可以是，但不限于如下种类之一或不同种类的组合(1)核糖核酸[RNA]，各种核糖核酸[″ribonucleic acid″and″RNA″]，包括信使RNA[简称mRNA]、转录RNA[简称tRNA]等，(2)脱氧核糖核酸[DNA]如DNA，互补DNA[cDNA]等，(3)寡核苷酸[oligonucleotide]，包括寡聚脱氧核糖核酸[oligodeoxynucleotide，简称ODNs]，寡聚核糖核酸[oligoribonucleotide，ORNs]，多聚核苷酸[polynucleotide]，(4)核酸结构相似物[DNA-DNA，RNA-RNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，等]]如肽核酸[peptide nucleic acids，简称PNA]，(5)脱氧核糖核酸、核糖核酸及其结构相似物的互补双链、三[重]链、四[重]链等形式的杂交分子如DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA、PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA]等，基因芯片的检测原理可以是，但不限于如下种类之一或不同原理的结合(1)通过对固相表面定位在不同位置的探针-靶特异性杂交反应进行光学信号[如荧光分子、化学发光等]标记，然后经激发产生荧光、化学或生物发光并进行检测，(2)通过对标记的或未标记的探针或靶在施加了电压的液相中的移动速度或迁移率进行检测，即电泳技术或由电泳技术与其他技术结合而产生的其他技术，如毛细管电泳[capillary electrophoresis，CE]、毛细管区带电泳[capillary zone electrophoresis，CZE]、毛细管凝胶电泳[CGE]、高效毛细管电泳[HPCE]、毛细管等电聚焦[capillary isoelectric focusing(CIEF)]、等速电泳[isotachophoresis(ITP)]、动电色谱[electrokinetic chromatography(EKC)]、胶束动电毛细管色谱[micellar electrokinetic capillary chromatography(MECC OR MEKC)]、毛细管电色谱法[capillary electrochromatography(CEC)]、非水相毛细管电泳[non-aqueous capillary electrophoresis(NACE)]等，(3)通过探针、靶或探针-靶络合物以及它们的标记物不同的亲和力，进行色谱技术分析，如亲和层析[affinity chromatography]，SEC[size exclusion chromatography]，GPC[gel permeationchromatography]，MCC[metal chelate chromatography]等，(4)利用具有氧化还原性质的分子或分子的部分结构[即化学基团或功能团]、金属络合物或(核酸)嵌入剂与被定位并固定在固相表面不同位置或电极上的探针、靶或探针-靶络合物结合并在外加适当方式或适当大小的电压(或电势差)作用(直流电压或交变电流或脉冲电场或电压)下，发生氧化还原反应，致使从还原性分子或基团(电子授体，electron donor)的电子转移到氧化性分子或基团(电子受体，electron acceptor)，形成电子流，通过电极传送到检测系统进行测量，所测得的电流强度大小与杂交并被标记的双链核酸的量成正比，(5)利用双链核酸和单链核酸的导电性能差异，或利用由序列完全互补配对的核酸杂交所形成的双链核酸分子与有错配碱基对(Mismatches)存在的双链核酸(nucleic acids duplexes)分子之间在导电性能差异，通过对经由核酸分子传导的电子流大小的测量而对核酸分子由此所反映的其他方面所进行的各种鉴别、检测和考察，如在基因突变、基因多态性、基因测序、基因表达谱研究、疾病机理分析和疾病诊断等方面的应用，(6)将发生在核酸分子上或由具有氧化还原性质的物质(包括但不限于，具有氧化还原性质的金属络合物以及由金属络合物或金属络合物的衍生物为单体聚合而成的聚合物、荧光分子、核酸嵌入剂等)所发生的电子或电荷转移反应或电子流转换成其他可检测或可考察形式的检测技术，如通过电致发光[Electroluminescence]原理，利用电致发光分子将电子流转换为光信号所进行的检测，(7)直接或间接以具有氧化还原性物质(如二茂铁基)对探针或靶分子标记物，通过标记后可以使标记物接近电极表面而发生电子转移反应从而实现对发生在电极表面的生物或化学反应的检测。
4.根据权利要求1所述的双探针基因芯片信号放大技术，其标记反应模式可以是，但不限于如下通式所描述的几种情景(1)单一样本来源的靶基因与标记探针优先杂交，在杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，再与基因芯片上的捕获探针特异性杂交，同样在捕获探针与靶基因所形成的杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，形成双探针杂交标记的靶基因，(2)两种或两种以上不同样本来源的靶基因分别与不同特性的标记探针优先杂交，从而使不同来源的靶基因各自被特异性的标记探针所定义，在杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，再与基因芯片上的捕获探针特异性杂交，同样在捕获探针与靶基因所形成的杂交双链进行或未进行链间交联或锁定之后，形成双探针杂交标记的靶基因，(3)单一来源的靶基因与捕获探针和标记探针同时进行杂交过程，之后，进行或未进行杂交双链的链间锁定过程以强化标记和杂交双链的连接强度，标记探针的结构可以用通式(I)表示，通式(I)F(-L2-XNA)n，或F(-XNA)n，用以核酸双链链间交联或锁定的化合物以X表示，可以分别是如下情况之一或不同类型化合物的组合使用，X-是与双链核酸通过静电吸引力、次键力[如范德华力、氢键等]、与双螺旋结构中的大沟或小沟的亲和力[Groove binders]、嵌入双链碱基对的亲和力[intercalators]、与双螺旋结构形成三螺旋结构或四螺旋结构等方式相结合的功能团，与核酸双螺旋结构通过化学反应形成共价键结合的功能团或分子，可以特异性识别核酸双链结构并与之结合的生物分子，可与核酸双链络合或结合的各种生物或化学分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物为结构基础或特征的各种衍生物和生物或化学修饰后所形成的化合物X-的结构特征根据其与为杂交单链核酸或与已经互补杂交的核酸双螺旋结构发生相互作用性质可以分为如下几种类型(1)静电吸引力、次键力[如范德华力、氢键等]，与核酸双螺旋结构中的大沟或小沟的亲和力[Groove binders]。属于这种情况的X-可以是，但不限于如下几类物质(1)以双螺旋大沟[majorgrooves]为作用机理的嵌入剂放射菌素类，如7-氨基-放射菌素D[7-amino-Actinomycin D]；与双螺旋小沟[minor grooves]形成络合物的咔唑类[如3，6-carbazole，2，7-carbazole]和二苯基呋喃二铵类[diphenylfurandiamindine]，聚胺类[polyamines]DNA嵌入剂，吲醌类嵌入剂[6H-indoloquinoline core]，烷基氨基烷基链[alkylaminoalkyl chain，DNA小沟嵌入剂]，(2)可以嵌入杂交核酸双螺旋碱基对的亲和力[intercalators]，属于这种情况的X-可以是(a)在一定条件下，可以形成链间共价交联的一类化合物，如补骨脂素(Psoralen)、异补骨脂素以及它们的任何衍生物形式，如4’-羟甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(4’-hydroxymethyl-4，5’，8-trioxalen，简写HMT)等，光激发嵌入剂[Ru(phen)2dppz2+；phen＝1，10-phenanthroline；dppz＝dipyridophenazine]，顺氯氨铂[cisplatin]，兼具DNA光损伤性质的嵌入剂吲哚基喹啉正离子盐类或喹啉衍生物正离子盐类[indolo[2，3-b]-quinolizinium bromide]；(b)作为双链嵌入剂的EDTA过渡金属络合物类[如methinidiumpropyl EDTA Fe(II)]，2，7-diazapyrene(DAP)，DAPI[4’-6-diamidino-2-phyenylindole]，N-甲基化正离子[N-methylated cations DAP+and DAP2+]，吖啶类化合物{Acridine orange[3，6-bis(dimethylamino)acridine，HCl]}，双齿状吖啶类嵌入剂[bis-dentate acridineintercalators]、氨基氮蒽或氨基吖啶[9-aminoacridine(9AA)]，碘基或碘代吖啶类[2-iodine-125-iodoacridine]；(c)可切断DNA链结构的嵌入剂亚德里亚霉素或阿霉素[Adriamycin，或Doxorubicin]，elsamicin，Nogalamycin，Sanguinarine，Cherethyrine，anthracycline drug，leinamycin，Echinomycine，正定霉素或道诺霉素类[Daunomycin]，[Rebeccamycin]；(d)兼具核酸碱基嵌入功能和双螺旋沟槽嵌入功能的偏端霉素类化合物[distamycin]和纺锤菌素类化合物[netropsin]以及Hoechst 33258和Hoechst 3342等；(e)以次键力为主与双螺旋结构中的堆积碱基相互作用的亚甲基蓝[methylene blue(MB，MB+)，溴乙非啶或溴化二氨乙苯啡啶[ethidium bromide]和二溴乙锭正离子[diethdium cathion]，(3)与双螺旋结构形成三螺旋结构或四螺旋结构等方式相结合的功能团，与核酸双螺旋结构通过化学反应形成共价键结合的功能团或分子，可以特异性识别核酸双链结构并与之结合的生物分子，可与核酸双链络合或结合的各种生物或化学分子，它可以包括但不限于下列化合物以及以下列化合物为结构基础或特征的各种衍生物所有可以嵌入核酸双链结构或核酸双链的大沟或小沟中的嵌入物、多聚嵌入物、线性或环状嵌入物等，(4)可与RNA形成各种络合物的核仁素类[如Nucleolin RBD12]，(5)可以在双螺旋结构中的多个位点进行嵌入的多重嵌入剂，比如将棘皮霉素类[Echinomycine，DNA双重嵌入剂]通过共价键偶联起来，或串联起来，可以形成四重嵌入的四重嵌入剂；(6)重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐[berenil]，细胞毒素类[如cytotoxin NLCQ-1]，三骨菌素[triostin]，黄连素类[如protoberberine-8]，，口腔M[Gilvocarcin M]，呋喃萘基吡喃酮类[furonaphthopyrone]，卟啉或金属卟啉类化合物[porphyrins or metalloporphyrins]，咔啉类化合物[如beta-carbolines]，原黄素[proflavin(Acr-NH2)]，3，7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium chloride]，苯基巯基吡喃[benzothiopyranoindazole]，[水溶性]亚丙基碘化物[propidium iodide]，(7)以芳香环结构堆积为特征的线状多聚DNA嵌入物[thestacked aedamer core，具有两个或若干个1，4，5，8-四羧酸二酰亚胺(1，4，5，8-tetracarboxylic diimide)等特征结构单元多聚嵌入物]，(8)可以产生电化学信号的嵌入物二茂铁基萘二酰亚胺类线状嵌入剂[threading ferrocenyl naphthaline diimide](9)蒽类[anthryl compands如AMAC[9-氨基-6-氯-2-甲氧基哑啶(9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine)]，anthracycline，APAC，N-Et-AMAC等]，蒽醌类[anthraquinones]，萘二酰亚胺类嵌入剂[naphthalene diimide intercalators]，菲离子类嵌入剂[phenanthridinium intercalators]，(10)金属类嵌入剂，如八面体DNA铑嵌入剂[rhodium intercalator，bis(2-2′bipyridyl)chrysene quinonediimine，D-[Rh[(R，R)-Me 2 trien]phi] 3+，Ru(NH2)63+]，有手性络合物结构的金属钌嵌入剂[rutheniumintercalators，[Ru(phen)2 dppz]2+(phen＝1，10-phenantroline；dppz＝dipyrido[3，2-a2′，3′-c]phenazine)]，terpyridine platinum compound(TPH)，mitoxantrone，镧系金属化合物DNA嵌入剂[lanthanide]，二吡啶基(乙二胺)铂盐或三吡啶基铂盐类[bipyridyl(ethylenediamine)Pt(II)2+，4-picoline-2，2’6’，2”-terpyridine-platinum]，(11)可改变双螺旋沟槽结构的萘二酰亚胺类化合物[双嵌入剂，如naphthalene diimides，N，N’-disubstitutednaphthalene diimide derivatives，用多肽链作为嵌入双螺旋小沟的连接臂的萘四羧酸二酰亚胺双嵌入剂(1，4，5，8-Naphthalene Tetracarboxylic Diimide Bis-Intercalator with the Linker(-Ala)3-Lys in the MinorGroove)，用胺基烷基将DNA嵌入功能团线性连接起来所形成的双嵌入剂，三嵌入剂，多聚嵌入剂和有环双线状嵌入剂等]，(12)荷苞牡丹碱类[dicentrine]，三环大那霉素类[tricyclic dynemicin A]，硝基胺类[nitracrine，亲电子性DNA嵌入剂]，环磷酰胺类[cyclophosphamide]，amsacrine，丹参酮类[如Dihydrotanshinone，I]，octahydroxanthene，吲唑类[indazoles，如benzothiopyranoindazole DNA嵌入剂]，咪唑类[imidazole]，N-[4-(9-吖啶基氨基)-3-甲氧基-苯基]甲烷-磺胺类化合物[N-[4-(9-acrydinylamino)-3-methoxy-phenyl]methane-sulphonamide，m-AMSA]，大环内酰胺类[macrocycliclactam]，喹啉衍生物类嵌入剂{如indolo[2，3-b]quinolines，6H-indoloquinoline core，quinoxalines}，Amsacrine，(夹)氧杂蒽类[Xanthenes，如1，8-二氧代-9-(o-硝基苯基)-1，2，3，4，5，6，7，8八氢氧杂蒽(1，8-dioxo-9-(o-nitrophenyl)1，2，3，4，5，6，7，8-octahydroxanthene)]，luzopeptin，甘菊环类[6a，7-diazanaphth[3，2，1-cd]azulene和7H-1，7-diazaindoleno[1，2e]azulene system]，Ditercalinium，4，6-diamidino-2-phenyline[DAPI]，戊烷脒类[pentamidine]，(13)Pixantrone，基于吲哚结构的玫瑰树碱类[indole-based intercalator ellipticine]，奎吖因类[quinacrine]，重氮化合物类[4，9-diazapyrenium]，雌甾二醇类[estradiol]，双苯基酰亚胺类[bisbenzimide]，噻唑类[如thiazole orange]，(14)光活性生物素或光生物素[photoactivable biotin，photobiotin]、光生物素与生物分子或化学分子的偶联体、及光生物素的衍生物，可断链的光生物素[如photoactivable cleavablebiotin]，(15)所有可以对核酸进行染色的染料分子，如荧光染料bisbenzimide H fluorochrome [TriHCl]，色霉素[chromomycin]A3，荧光性嵌入剂[如TOTO，YOYO，SYBR Green]，(16)所有可以与基因芯片上的已互补杂交的核酸双螺旋结构形成三重(倍)[triplex]螺旋或四重(倍)[quadruplex]螺旋结构的化合物或生物分子或生物分子结构类似物以及此结构与其他分子共价偶联所形成的复杂分子结构，如PNA[peptidenucleic acids]，寡聚核苷酸，多肽[如[N-MeCys3，N-MeCys7]TANDEM]等；(17)可与核酸双链发生化学反应或光化学反应从而形成共价键连接的功能团或分子，如叠氮类化合物，结构中含有苯甲酮功能团的化合物及其衍生物。可以与核酸探针或靶基因发生共价交联的各种化学交联剂或化学反应功能团如可以通过与靶基因上的羟基发生缩水反应的碳二亚胺，或光化学反应活性的交联剂，如芳香基叠氮化合物[aryl azides，如N-((2-pyridyldithio)ethyl)-4-azidosalicylamide[PEAS]等]、氟代芳香基叠氮化合物[fluorinated aryl azides]，苯甲酮类光反应试剂[benzophenone-based photoreactive reagents，如苯甲酮马来酰亚胺[benzophenonemaleimide]]等；(18)可以序列特异性地或非序列特异性地识别核酸双链结构并与之结合或以双链核酸的双螺旋结构为底物的蛋白质或酶等生物分子，如HMGB蛋白，可与经顺氯氨铂修饰的dsDNA结合的NHP6A蛋白，参与DNA复制的酶、凝血酶[thrombin]、RNA转录的酶丝裂霉素[Mitomycin C]、可以与核酸双螺旋结构的双链间形成共价桥形键的博来霉素或争光霉素类[Bleomycin]、双链核酸抗体、双链核酸的特异性结合酶，DNA聚合酶或RNA聚合酶，(19)可以与待测靶基因或基因芯片上探针核酸分子的某个或某些特异性序列进行特异性互补并结合形成互补双链结构的寡聚核苷酸分子，反义核酸[anti-sense nucleic acidsequences]序列等，该类化合物可以同时适用于杂交前标记和杂交后标记两种方案，(20)具有氧化还原[redox]性质，可以发生电子授受反应[Electron Donor-Acceptor Reaction]或电子转移反应[Electron-TransferReaction]的核酸结合物以及以这些化合物为单体聚合而成的聚合物和低聚物、寡聚物，如[a]可以嵌入核酸双链中的荧光分子有但不限于，亚甲基蓝[Methylene Blue，MB+]和Hoechst33258等荧光分子等，或[b]金属络合物，如钌金属络合物[Ruthenium tris(2，2’-bipyridine)]等，或[c]通过共价键连接或非共价键结合与上述任何一种核酸嵌入剂发生共价交联或非共价键结合的具有氧化还原性质的高荷信号载体[HSC]，包括但不限于，多聚二茂铁基团[polyferrocenyl]、多聚二茂锆基团、多聚二茂钌基团等多聚二茂金属类物质，(21)核酸结构类似物[nucleic acid mimics]，如PNA[peptide nucleic acids]，可以与核酸形成稳定结合物，-L-可以是但不限于如下各种结构或分子(1)溶剂相容性连接臂，即当溶剂为疏水体系时，连接臂亦为疏水连接臂；当溶剂为亲水体系时，连接臂亦为亲水连接臂，可以是PEG、合成多肽等，长度不限，(2)分子导线[molecular wires，如双链DNA分子，亲水性连接臂，珠链型富勒烯线型聚合物(富勒烯被导入有机高分子主链的珠链型高分子)或将富勒烯[巴基球，fullerene]用R基连接起来的巴基球项链等]，(3)分子绝缘体[molecular insulators，如疏水性连接臂，长链烷烃等]，(4)结合有分子磁体的连接臂，(5)在化学或光学等因素作用下，分子链可以断链的连接臂等，如双硫键[-SS-]等，F表示以各种微小颗粒形式存在的高载荷光学、磁性、电子学或电化学信号载体，它可以是高聚物或共聚物荧光微球、表面修饰有荧光染料的硅氧磁珠[silica beads]、半导体纳米晶量子点[quantumdots，QDs]、高分子微球与量子点相结合的产物量子点微球[QD-tagged nanobeads or microspheres]、蛋白质包裹的半导体纳米颗粒或微颗粒或量子点[如Chaperonin mediated semiconductor nanoparticles]、树枝状高分子或树形分子[dendrimers]、星形树枝状高分子[dendrimeric stars]、胶束[micelles]、分子磁体[molecular magnets]、胶囊式微球[encapsulated spheres]、胶体纳米金[colloidal gold nanoparticles]、电致发光分子[electroluminescent molecules]、二茂金属基共聚物微球[polymetalcene block copolymers，如二茂铁基聚合物[polyferrocene block copolymers，PFC，或polyferrocenylsilanes，PFS]微球，多聚二茂锆[polyzirconocene，PZC]、多聚二茂金属基修饰或接枝的树枝状高分子[包括但不限于，聚二茂铁基接枝的树枝状高分子(polyferrocenyl-branched dendrimers)]、二茂金属基或多聚二茂金属基修饰或接枝的纳米金胶体[包括但不限于，胺基二茂铁基功能化的纳米金胶体(Gold colloids functionalized withamidoferrocenyl structures)等]、共聚物微球或纳米球、含有富勒烯结构的或以富勒烯为单体之一的高聚物或共聚物、其它含荧光染料或化学发光[chemiluminescence]、生物发光[bioluminescence]材料的载体，藻胆蛋白类[phycobiliproteins]及其各种衍生物或生物或化学修饰物，以及上述每一种载体中不同参数[如大小、光学发射光波长、电磁学性质、表面生物或化学功能团修饰等物理或化学性质]载体的组合，或各种不同载体之间的相互组合，n是从零到无穷大的自然数0，1，2，3...，XNA表示核酸及其结构类似物，如单链或互补杂交的双链核酸[含寡核苷酸]及其相似物[DNA，RNA，PNA，DNA-DNA，RNA-RNA，RNA-DNA or RNA-DNA mimic duplexes，triplexes or quadroplexes，PNA-DNA，PNA-RNA，PNA-RNA-PNA，PNA-DNA-PNA等]，
5.一种根据权利要求1制作的基因芯片双探针信号标记和放大试剂盒，即BAT试剂盒，包含了基因芯片处理各过程所需要的全部生化试剂，含有但不限于如下通式所表示的核心组分通式(I)化合物。
全文摘要
本发明提供了一套双探针基因芯片信号放大方法。其原理是设计两个或多个与靶基因特异性位点的碱基序列互补的两个或多个探针，即捕获探针和标记探针。其中以固定于基因芯片上微点阵中核酸探针为捕获探针，另外至少一个与待测靶基因特异性位点碱基序列互补配对的核酸上通过化学共价键或非共价键连接高荷信号载体，成为标记探针。后者实际上是一种有强大信号放大能力的标记靶基因。通过将各种不同形式的高荷信号载体[HSC]应用于基因芯片的信号放大标记和检测过程，从而大大地提高了基因芯片信号检测灵敏度和信噪比。通过制备大量标记靶基因或标记探针，可以实现对不同核酸分子的高通量分析。在一些实施例中，各种HSC如高分子荧光微球、量子点[QD]、树形分子[Dendrimers]、多聚二茂铁、量子点微球[QD－tagged Beads]等被应用于基因芯片、微流体电泳芯片等生物芯片的检测中。利用该技术标记之后的微阵列，在激光共聚焦扫描仪、CCD、荧光显微镜和等离子体共振激发技术等条件下，可以检测到在微阵列上发生的单个标记事件，因而是一种微阵列超灵敏检测技术。该技术尤其适合于临床诊断等领域的基因芯片检测。
文档编号C12Q1/68GK1570140SQ0314184
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者宋克 申请人:宋克