一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者 的分子检测方法。
【背景技术】
[0002] 荷斯坦奶牛是提供人类乳品的重要家畜品种，经高度的选育与良好的饲养管理， 生产大量鲜乳供应我们食物的需求。由于遗传育种与人工授精技术的卓越成果，有潜力的 优良公牛被用于制作大量冷冻精液，供给很多母牛配种使用，其优良遗传性能可以迅速地 传播至世界各地。如果追溯全世界荷斯坦奶牛的系谱，其亲缘大都密集地来自几个特定的 公牛家族。然而，人工授精技术的应用使得遗传缺陷的传播也更加快速，影响层面也更加宽 广。
[0003] 遗传缺陷指会藉由亲代传给子代的缺陷，是由特定基因所引起的生化功能丧失或 不正常的表型。体细胞遗传缺陷可分为显性遗传缺陷与隐性遗传缺陷两种。遗传缺陷若是 显性且外发于身体畸型或残缺，一般会比较容易被察觉，但是大部分的遗传缺陷却都是隐 性的。若是隐性遗传缺陷，则杂合型个体虽带有一个异常等位基因，外表却看不出来。必需 带有二个隐性致病基因（aa)的个体才会发生异常的遗传缺陷（这里以a表示致病基因，A 表示正常基因）。杂合型公牛（Aa)虽然只带有一个a，但其却是a基因携带者。这种Aa杂 合型公牛常会有健壮外观，女儿牛表现优良，导致a基因在子代、孙代、曾孙代…逐渐传递， 经过多代的人工授精，a基因携带者在群体中所占比例就大大提高，从而导致带有二个隐性 致病基因（aa)的个体出现。因为带有隐性致病基因的个体与同样带有隐性致病基因的个 体配种后，其二分之一后代为带隐性致病基因杂合型个体（Aa)，四分之一后代为发病型个 体（aa)，四分之一后代为正常型个体（AA)。
[0004] 脊椎畸形综合征（ComplexVertebralMalformation,CVM)是荷斯坦奶牛的一种 常染色体单基因控制的隐性遗传疾病，最早由丹麦科学家Agerholm报道。随后在美国、荷 兰、英国、日本等国家的荷斯坦奶牛中也相继发现。CVM的主要症状为流产、早产和死胎。 患病犊牛体型较小、体重偏轻，颈部较短，颈部和/或胸部脊椎骨或肋骨出现各式各样的病 变，同时四肢关节僵直、呈现对称的向后方翻转弯曲。另外，CVM对奶牛的繁殖性状也有很 大的影响，母牛的不返情率提高，产犊间隔大大延长，流产比例增加。由于CVM导致一半以 上的母牛流产都发生在受孕后100-260天，这段时间是母牛的产奶高峰期，流产导致奶牛 产奶量难以提高，造成母牛非计划性淘汰，因此带来严重的经济损失。
[0005] 丹麦科学家通过对CVM患病犊牛系谱分析发现，几乎所有患病犊牛都可以追溯 到一个共同祖先，Carlin-MIvanhoeBell。该公牛是世界著名的优秀种公牛，在全世界 范围内使用时间长达二十几年之久，留下了大量的优秀种公牛后代，同时也导致该病具有 分布广、频率高的特点（ThomsenB，HornP，PanitzF，etal.Amissensemutationin thebovineSLC35A3gene，encodingaUDP-N-acetyIglucosaminetransporter,causes complexvertebralmalformation[J]. 2006,GenomeResearch，16(I) :97-105)〇CVM的分子遗传学基础是由位于奶牛第3号染色体（BTA3)上的SLC35A3基因外显子4的 第559位的单碱基突变（G/T)所致，该基因编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转 运蛋白（UDP-N-acetylglucosaminetransporter)，负责把尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基 葡萄糖从细胞质中转运到高尔基体中，点突变导致尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖 转运蛋白的第180位的氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸，从而影响了其正常功能，导致 CVM(ThomsenB，HornP，PanitzF,etal.AmissensemutationinthebovineSLC35A3 gene,encodingaUDP-N-acetyIglucosaminetransporter,causescomplexvertebral malformation[J].2006，GenomeResearch，16(l) :97_105)。目前丹麦、美国、加拿大等奶 牛业发达国家都已经建立了完善的荷斯坦公牛CVM监测体系，所有公牛的CVM检测结果都 要进行标识和公布，并记录在其系谱内，CV(carrierofCVM)表示CVM携带者，TV(tested freeofCVM)表示非携带者。
[0006]英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室）有限公司 成立于1842年，是集实验室服务、测量标准、标准物质及实验室能力验证于一体的市场领 导者。LGC基因组学（LGCGenomics)作为其新设的技术部门，为全球的基因组学实验室提 供了最新的技术方法和设备。由该部门所开发的竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-SpecificPCR，KASP)技术，已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。这项技 术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP进行分型以及检测InDels(Insertionsand Deletions，插入和缺失）的，通过使用2个荧光探针、2个通用淬灭探针，再加多个位点特 异探针即可检则多个SNP位点，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。其基本过 程是：①设计特定的引物和焚光探针构成PrimerMix;②PCR反应I:变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测引物的序列；③PCR反应II:等 位基因特异性的末端序列的互补链合成；④PCR反应III:信号产生特异序列对应的检 测引物随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测；⑤根据信号检测结果即可判断某SNP 位点的基因型。
[0007]目前我国用于筛查荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征携带者的分子检测方法主要有PCR-SSCP技术和PIRA-PCR技术等，但上述方法包含PCR反应、酶切、凝胶电泳、银染、紫外成 像、人工观察结果等一系列步骤，过程相对繁琐，具有费时费力、因结果需要人为判断而增 加误判几率、实验中需要接触有毒有害试剂（如电泳时所用的染料溴化乙锭）等特点。由 于以上特点，目前常用的分子检测方法在实际操作中容易出现浪费大量人力物力，工作效 率低下等问题，并不适合大批量地检测筛查荷斯坦奶牛CVM携带者。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是提供一种鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特 异性PCR成套引物。
[0009] 本发明提供的成套引物，为如下1)或2)
[0010] 1)由引物4、引物5和引物3组成；
[0011] 2)由引物1、引物2和引物3组成；
[0012] 所述引物1的核苷酸序列为序列1 ;
[0013] 所述引物2的核苷酸序列为序列2 ;
[0014] 所述引物3的核苷酸序列为序列3 ;
[0015] 所述引物4的核苷酸序列为序列4;
[0016] 所述引物5的核苷酸序列为序列5。
[0017] 上述成套引物中，所述引物4和所述引物5的5'端均连有不同的荧光基团。
[0018] 所述引物4的5'端连有FAM荧光基团；
[0019] 所述引物5的5'端连有HEX荧光基团。
[0020] 上述成套引物中，1)中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩尔比为2 :2 :5;
[0021] 2)中，所述引物4、所述引物5和所述引物3的摩尔比为2 :2 :5。
[0022] 本发明的另一个目的是提供鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异 性PCR试剂。
[0023] 本发明提供的PCR试剂，包括上述的成套引物；
[0024] 所述成套引物中的引物3在所述PCR试剂中的浓度为30 yM ;
[0025] 所述成套引物中的引物4和引物5在所述PCR试剂中的浓度均为30yM。
[0026] 本发明第三个目的是提供鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的竞争性等位基因特异性 PCR试剂盒。
[0027] 本发明提供的试剂盒，包括上述的成套引物或上述的PCR试剂。
[0028] 上述的成套引物或上述的成套引物或上述的试剂盒在制备鉴定荷斯坦牛是否携 带CVM产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0029] 所述引物4的5'端连有FAM荧光基团；
[0030] 所述引物5的5'端连有HEX荧光基团。
[0031] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的方法。
[0032] 本发明提供的方法包括如下步骤：用上述的成套引物中的1)对荷斯坦牛进行荧 光定量PCR扩增，检测PCR扩增产物的荧光信号；若PCR扩增产物发FAM荧光，则待测牛不 携带或候选不携带CVM;若PCR扩增产物发HEX荧光，则待测牛携带或候选携带CVM。
[0033] 上述荧光定量PCR扩增的模板为荷斯坦牛的冻精、血液或组织的基因组DNA。
[0034] 本发明鉴定荷斯坦牛是否携带CVM的奶牛DNA样品可通过提取奶牛冻精、血液、组 织等获得；所提供的引物可通过具有引物合成服务的公司合成获得；所述的KASPMaster mix试剂可通过LGC公司直接购得；其他试剂均可为现有的常规试剂。
[0035] 本发明的实验证明，本发明利用KASP技术，通过设计一组针对CVM突变位点的引 物，将配置好的PCR反应体系置于可检测荧光信号的PCR仪（本发明所用仪器为德国Roche LightCycleMSO实时荧光定量PCR仪）中，按照设置好的反应程序（LGC公司提供）进行反 应，经过约1. 5小时后通过配套的软件进行简单识别分析，即可准确获得所有待测样品的 基因型，从而实现筛查CVM携带者的目的。
【附图说明】
[0036] 图1为使用KA