专利名称：用于鉴定牛脊椎畸形综合征携带者的遗传试验的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及在牛中发现的称为脊椎畸形综合征(CVM)的遗传性疾病。更具体的说，本发明涉及用于鉴定潜在的CVM牛携带者和用于鉴定CVM基因座及其负责牛脊椎畸形综合征的突变的分子标记。
背景技术：
脊椎畸形综合征(CVM)是在Holstein-Friesian(HF)黑白花奶牛中发现的先天性脊椎病症。该疾病在最近被描述(Agerholm等，2000)。在丹麦，至今(2000年10月17日)诊断的所有病例都在遗传上与以前的原种美国Holstein公牛Carlin-M IvanhoeBell有亲缘关系。根据现在的资料，CVM似乎是作为常染色体隐性疾病遗传的。
该疾病的特征在于先天性远侧关节的两侧对称性关节弯曲和脊柱畸形，主要发生在颈-胸会合处，并伴随着体重下降(Agerholm等，1994)。
在外表上，有下列主要发现在许多病例中，脊柱的颈部和/或胸部部分似乎缩短。经常发现中度的腕关节两侧对称性收缩和趾骨-掌骨关节(球节)严重收缩和旋后。还通常发现趾骨-跖骨关节的收缩和旋前及跗骨的轻微伸展。在大多数病例中观察到颈-胸会合处周围的脊柱路线不规则(irregular course)。可观察到脊柱侧凸，且在脊柱的其它区域存在病变。通常可通过对脊柱腹面的望诊和触诊识别这种路线不规则。然而，病变可最小且局限于两个或少数椎骨。在这种情况下脊柱可以是几乎正常的长度。因此，建议对脊柱进行放射学检查以排除疑似病例中的脊椎畸形。脊索具有正常的大小，位于椎管中，且没有明显的压迫。使用放射学可发现各种程度的由半脊椎畸形，融合和异形脊椎，脊柱侧凸和关节僵硬组成的脊椎畸形综合征。在取出椎弓后可最好地证实这点。在有些病例中，存在心脏畸形，主要表现为高度室间隔膜缺陷和右心室偏心肥大。可能出现大血管畸形。在肺部，存在胎儿肺膨胀不全。大多数在胸腔存在浆液出血性液体。已经观察到各种其它畸形，但是没有恒定的或者共有的发现。通常发现由难产引起的损伤。
在流产的胎牛，早产牛犊和到期出生的死产牛犊中都观察到畸形。在较大的牛犊中尚未观察到这种情况。一般来说体重减小，且早产牛犊比到期出生的牛犊体重更低。
另外，似乎在用携带者公牛的精子授精的母牛中流产频率增大。其原因至今还不清楚。
目前，可用于CVM诊断的唯一工具是根据上述出现主要发生在颈-胸会合处的远侧关节的两侧对称性关节弯曲和脊柱畸形并伴随着体重下降的病理解剖诊断。然而，四肢的对称收缩是牛犊脊椎畸形中的常见和普遍发现。因此，存在鉴别诊断的问题，因为通常难以区分CVM和其它畸形。
该遗传缺陷似乎通过已在全世界集中使用的公牛Carlin-MIvanhoe Bell传播的事实使得能够试验当前的和潜在的育种公牛是否是缺陷携带者具有重大的经济重要性。
为了获得丹麦牛种群中潜在的CVM携带者动物的频率的估计量，本发明人从丹麦国家牛数据库提取了谱系信息。提取时(2000年10月)，登记有919，916头纯育母牛和小母牛，以及169，821头纯育公牛和雄性牛犊。在母牛和小母牛谱系中发现Bell707，915次，在雄性谱系中发现161，043次。在下面表1和2中，显示了谱系每代中Bell的出现数。
表1丹麦Holstein母牛和小母牛谱系中Bell的出现次数世代NR 频率百分率 累计频率2212403.0212443202460 28.6 2237044321043 45.4 5447475133956 18.9 6787036273073.970601071869 0.3707879836 0.0707915
表2丹麦Holstein公牛谱系中Bell的出现次数世代 频率百分率 累计频率2436 0.3 43632014412.52058048239451.210297454454527.71475196124557.7 15997471040 0.6 161014829 0.0 161043尽管这些数值也包括一些在谱系中出现两次和三次的Bell，但是该数据清楚地显示了大多数丹麦Holstein牛是潜在的CVM携带者。很明显，该问题在全球范围内是非常普遍的。
因此，在牛工业中对于允许在各种品系的牛中鉴定潜在CVM携带者(例如，在可检测的临床症状出现前)的遗传学试验存在巨大的需求。
在本发明之前，小随体(microsatellite)作图法尚未应用于未被分离或鉴定的引起上述脊椎畸形综合征的基因上。因此，就本发明人所知，在下面进一步详细描述的根据本发明的诊断方法以前尚未被提出或公开过。
因此，包含CVM疾病基因座作图的本发明提供了以位于牛染色体BTA3上的小随体标记为基础的DNA试验。从下面的实施例显示出该试验确定Bell后代动物携带状况的能力已得到证实。
发明概述在其最广义的方面，本发明提供了一种检测牛受试者中存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的遗传标记的方法，包括提供牛遗传物质，并检测该遗传物质中是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的至少一种遗传标记或引起脊椎畸形综合征疾病性状的特定核苷酸多态性的步骤。
在另一方面，本发明涉及用于检测牛受试者中存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的至少一种遗传标记的诊断试剂盒，包含选自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ IDNO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38及其组合组成的组中的至少一种寡核苷酸序列。另外，本发明涉及一种诊断方法，包括一种用于检测作为牛CVM病因和诊断特征的牛SLC35A3基因中的G/T多态性的诊断试剂盒。
发明详细描述本发明的一个首要目的是使得能够鉴定携带牛脊椎畸形综合征(CVM)的牛。通过检测牛受试者中存在与牛CMV相关的遗传标记的方法来实现这点。更具体地说，该遗传标记可以是牛SLC35A3基因或甚至更具体地说是牛SLC35A3基因中的特定多态性。
本文使用的术语“牛受试者”是指任何品种的牛。因此，任何各种母牛或公牛品种，无论雌雄，都包含在该术语中，且成年的和新生的动物都打算包括在内。该术语不指示具体年龄。牛受试者的一个例子是Holstein-Friesian牛种群中的一个成员。
术语“遗传标记”是指存在于染色体上的牛基因组DNA中且用特定寡核苷酸可鉴定的可变核苷酸序列(多态性)。例如，这种可变核苷酸序列通过核酸扩增并观察由多态性引起的大小或核苷酸序列上的差异可进行辨别。在有用的实施方案中，该遗传标记可通过本领域的技术人员已知的各种技术进行鉴定，且包括通过包括限制性片断长度聚合酶链反应，等位基因特异性寡聚体杂交，寡聚体特异性连接试验，微型测序，直接测序，检测荧光的5’-核酸外切酶试验，和用PNA和LNA探针杂交等的方法进行的小随体或短串联重复(STR)的分类，限制性片断长度多态性(RFLP)，缺失或插入位点的检测，和随机扩增多态性DNA(RAPD)以及单核苷酸多态性(SNP)的分类。
如上所述，“牛脊椎畸形综合征”(CVM)是一种先天性脊椎病症。目前，该疾病仅在Holstein-Friesian(HF)黑白花奶牛中检测到；然而，可预期其它的牛品种也会患病。最近Agerholm等，2000已经描述了该疾病。因此，在本文中CVM和牛脊椎畸形综合征疾病特征理解为导致本文前面所述的，且如Agerholm等，2000报道和限定的临床症状的疾病。
根据本发明的方法包括提供牛的遗传物质，该物质包括可通过任何常规方法或手段提供的牛DNA材料。例如，牛DNA材料可从血液(例如，新鲜或冷冻的)，组织样品(例如，脾脏，颊膜涂片)，含有毛囊细胞的毛发样品和精子提取，分离和纯化。
如前所述，本发明的方法还包括检测遗传物质中是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的遗传标记的步骤。
为了检测遗传标记是否存在于遗传物质中，可应用本领域的技术人员熟知的标准方法，例如，通过使用核酸扩增。为了确定该遗传标记是否与脊椎畸形综合征疾病性状在遗传上连锁，可应用优势对数得分(lod score)。优势对数得分有时也称为Zmax，表示遗传标记座与特定基因座在特定距离连锁的概率(可能性比率的对数)。例如，优势对数得分可通过应用诸如LINKAGE软件包的MLINK程序的计算机程序进行计算(Lathrop等，1985)。优势对数得分大于3.0被认为是遗传标记与脊椎畸形综合征疾病性状或基因座之间连锁的重要证据。
在本发明的一个实施方案中，遗传标记位于牛染色体BTA3上。图2表示了含有在本发明方法中有用的遗传标记的牛染色体BTA3区。
因此，根据本发明有用的遗传标记位于牛染色体BTA3上的其两侧为多态性小随体标记BM4129和BMS1266且包含它们的区域上。在一个具体实施方案中，至少一个遗传标记位于牛染色体BTA3上从大约59.5cM到大约67.9cM的区域上。
在另一有用的实施方案中，至少一个遗传标记位于牛染色体BTA3上的其两侧为多态性小随体标记INRAA003和BMS937且包含它们的区域上。
在另一方面，至少一个遗传标记位于牛染色体BTA3上的其两侧为多态性小随体标记INRAA003和ILSTS029且包含它们的区域上。
在另一优选实施方案中，至少一个遗传标记选自由小随体标记BM4129，INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937，BL1048，BMS2095和BMS1266组成的组中。
如实施例中所述，至少一个遗传标记与引起牛脊椎畸形综合征疾病的基因连锁。因此，在一个实施方案中，至少一个遗传标记位于牛染色体BTA3上的其两侧为多态性小随体标记BM4129和BMS 1266且包含它们的区域上并与CVM疾病性状或CVM基因座在遗传上连锁，其优势对数得分为至少3.0，例如至少4.0，包括至少5.0，例如至少6.0，包括至少7.0，例如至少8.0，包括至少9.0，例如至少10.0，包括至少11.0，例如至少12.0。
上述多态性小随体标记的具体定义和座位参见USDA遗传图谱(Kappes等，1997)。
可预期为了检测牛受试者中是否存在与CVM相关的遗传标记，根据本发明可应用一个以上的遗传标记。因此，至少一个标记可以是显示出可提供更多信息从而可增强试验精确度的两个或多个遗传标记的组合。
因此，正如下面进一步的举例，在一个有用的实施方案中，可结合使用两个或多个小随体标记INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA 123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937。
根据本发明，下面表4中描述了用于扩增上述小随体标记的引物对的核苷酸序列。
比较图谱(Solinas-Toldo等，1995)显示大多数牛染色体BTA3相应于人染色体1的一部分(HSA1)。本文提供的CVM基因座的遗传学作图使得使用有关人基因的信息且集中寻找与人染色体1上存在的基因相对应的候选基因成为可能。这极大地限制了候选基因的数目且有利于寻找CVM致病基因。
本发明的遗传标记可使用本领域的技术人员已知的不同方法来制备。因此，使用本文提供的知识可理解，将牛染色体BTA3的上述多态性小随体标记的核苷酸序列鉴定为与CVM基因座在遗传上连锁，且可从已知序列或牛染色体BTA3上的指示位置产生其它标记用于本发明的方法。
例如，使用图2所示的图谱，可显微解剖牛染色体BTA3上的CVM区域，并将片断克隆进载体以分离DNA片断，可试验该片断与CVM基因座的连锁。另外，用表4提供的核苷酸序列，通过核酸扩增(例如，聚合酶链反应)或通过牛染色体BTA3有关区域的核苷酸测序(“染色体步查”)可从CVM区域获得分离的DNA片断。
另外，牛染色体BTA3和人染色体1(HSA1)之间的上述同源性表明，定位到人类该相似区域的任何基因或表达序列标记也可定位到牛染色体BTA3的CVM区域。因此，可使用常规方法分析定位到人染色体HSA1上的基因或保守序列与CVM基因座的连锁。
基因型确定以基因组分析为基础，使用本文所述的标准DNA提取方法可提供该基因组DNA。分离和纯化该基因组DNA时，可使用核酸扩增(例如，聚合酶链反应)来扩增相应于各遗传标记的DNA区域，该遗传标记用于检测牛受试者中存在与CVM相关的遗传标记的分析中。因此，用于这类实施方案的诊断试剂盒包含分开包装的选自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO1O，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38，及其组合组成的组中的至少一种寡核苷酸序列。
牛SLC35A3基因中的牛CVM病原性和诊断性突变的鉴定由于通过多态性小随体标记限定的CVM基因的基因组定位已经确定，因此可进行研究以鉴定本文的结构基因和病原性突变用作CMV的最终遗传标记。
鉴定了与CVM区域享有序列同源性的人基因组，确定为标记INRA003和ILSTS029之间的区域。标记BMS2790位于该间隔中(图1)。最初，从牛BAC文库(RPCI-42，由P.de Jonge及其同事构建和制备)鉴定了5个不同的克隆，各含有标记INRA003，ISLTS029，或BMS2790之一。使用从这些BAC克隆获得的序列信息，使用公共序列数据库的BLASTN程序鉴定了人染色体1上的单个区域，该区域含有与含标记的BAC同源的区域。该区域跨距大约6百万个碱基对且位于大约107.4-113.5的位置(图3)(ENSEMBL指示器，The Sanger Centre)。
SLC35A3 cDNA的分离和测序根据人(homo sapiens)和狗(canis familiaris)之间的SLC35A3基因的同源性序列对比，设计了2个寡聚体(SL1F和SL8R)用于扩增包括起始密码子的牛SLC35A3的几乎完整的cDNA。对分别从野生型动物，CVM携带者，和患病动物收集的心脏组织样品分离的cDNA进行了PCR。为了获得该基因3’-端的序列，测序所得的PCR片断并设计新的寡聚体(SLSF)。为了扩增SLC35A3的3’-端，将SL5F与使用部分牛EST的公开序列(genbank，dbEST)设计的寡聚体(bSLCBVIR)结合使用。图4显示了牛SLC35A3的cDNA序列(SEQ ID NO18)和翻译的肽序列(SEQ ID NO17)。牛SLC35A3编码的蛋白质含有326个氨基酸且与以前已知的参与核苷酸糖类从细胞溶胶向高尔基腔运输的蛋白质家族具有同源性。图5描述的序列对比显示了与以前在人类(Ishida等，1999)中和在狗(Guillen等，1998)中描述的SLC35A3蛋白质具有同源性。
检测SLC35A3基因中的多态性为了检测牛SLC35A3基因中潜在的多态性，使用分别从CVM携带者和患病动物收集的心脏组织样品分离的cDNA进行该基因的PCR扩增。测序从患病动物分离的片断揭示除了患病动物在核苷酸位置559是核苷酸T纯合型而相比之下野生型动物在相应位置是G纯合型外，其序列与野生型相同(见图4)。测序来自CVM-缺陷携带者动物的cDNA表明该动物是在位置559具有T和G的杂合型。
位置559上G交换为T影响了所得肽的序列，导致在1 80位由缬氨酸改变成苯丙氨酸(见图4)。
通过基于DNA测序的试验分类SLC35A3多态性图6显示了测序从基因组DNA扩增的且含有包含G/T突变的区域(SLC35A3 cDNA的544位至572位，编号见图4)的PCR片断获得的结果。左右组分别显示了正向和逆向测序。上排(标记为-/-)显示了野生型结果，显示了使用正向测序的多态性位置上的G，和使用逆向测序在另一链的相似位置上的C(标记为星号)。下排+/+显示了来自患病牛犊的结果，显示了使用正向测序的多态性位置上的T，和使用逆向测序在另一链的相似位置上的A(标记为星号)。杂合型(+/-)在中间一组中表示且按预期表现为野生型和患病信号的混合体，因此具有使用正向测序的T和G信号及另一链上的A和C信号。
患CVM的所有牛犊都是T-等位基因纯合型通过测序从基因组DNA扩增的PCR产物对患有CVM的39例牛犊进行基因型分类(见图6和实施例6)。所有这些动物都是T-等位基因纯合型，证实了开始的结果。
存与Bell无亲缘关系的动物中没有发现T-等位基因由于患有CVM的牛犊仅在含有广泛使用的公牛BELL的谱系中报道，我们调查了T-等位基因是否在与BELL无亲缘关系的动物中存在。利用丹麦牛数据库，鉴定了496例在其谱系中无BELL的Holstein品系动物并取样。通过测序从基因组DNA扩增的PCR产物对这些动物进行基因型分类(见图6和实施例6)。这些动物中没有一例含有T-等位基因，表明该等位基因专一性地在与BELL为近亲的动物品系中发现。
通过测序，对12个不同品种的超过326例无亲缘关系(至少在最近3代)的动物也进行了基因型分类。所有这些动物都是野生型等位基因(G-等位基因)纯合型，再次证实在一般牛种群中无CVM-相关性等位基因。
通过等位基因特异性PCR试验(AS-PCR)分类SLC35A3多态性为了有效分类G/T多态性，建立了使用Bioline的BIOLASEDiamond DNA聚合酶的等位基因特异性PCR试验。该聚合酶需要3’端引物与模板的完全匹配，且在该位置的一个错配将导致没有(或极弱)扩增。以这种方式，通过鉴定是否存在等位基因特异性PCR产物可区分野生型，携带者或患病动物(图7)。图7的左部分显示了编码链的等位基因特异性PCR产物。正如预期，野生型动物显示出用G-特异性引物扩增而用T-特异性引物则没有。携带者显示出G-和T-特异性引物都有扩增，而患病动物仅显示出T-特异性引物扩增。右部分显示了非编码链的等位基因特异性PCR产物，正如预期，情况与编码链相同。野生型动物为纯合型C，携带者为杂合型C/A，且患病动物为纯合型A。
根据上述使用定位候选基因研究的结果，鉴定了与编码UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白的人基因SLC35A3同源的牛基因。在该基因内鉴定了改变该蛋白质氨基酸序列的G/T多态性。分析的所有患病牛犊(39例)都是T-等位基因纯合型(T/T)且已知的携带者(108例)都是多态性杂合型(G/T)。对选择与BELL无亲缘关系的Holstein品种的超过500例动物的分析没有鉴定出任何携带T-等位基因的动物。分析了在谱系中具有BELL的超过1500只动物，没有发现任一未患病的动物是T-等位基因纯合型。另外，分析了选自12个不同品种的超过300只牛，在这些动物的任一例中都没有检测到T-等位基因。综合起来，本申请所述的发现证实了T-等位基因在CVM携带者动物中以单拷贝存在而在患有CVM的动物中以2个拷贝存在。因此，检测559位的T-等位基因(按图4的编号)是CVM的诊断特征和检测CVM缺陷携带者的最终目标。
由于G/T多态性被鉴定为CMV的病因，因此与该多态性紧密相连的任何遗传标记都可以是牛种群中CMV的诊断特征。因此，本发明描述了通过测定牛SLC35A3基因的559位G/T多态性的存在鉴定患有CMV或携带CMV的牛受试者的方法，通过分析与牛SLC35A3基因偶连的诸如本文所述的小随体的任何遗传标记来间接测定，或者通过分析诸如上文所述且在实施例中进一步详细描述的牛SLC35A3基因的序列直接测定。
因此，检测和/或定量牛受试者中与牛CVM相关的遗传标记的存在以便能够鉴定患有CMV的牛受试者或CMV携带者的方法在本发明的范围内。该方法的步骤包括a)提供牛遗传物质，和b)检测所述的遗传物质中是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的至少一种遗传标记。
至少一种遗传标记与引起牛CMV疾病的基因连锁，本文鉴定的所述基因是牛SLC35A3基因，它编码包含SEQ ID NO17所示氨基酸序列的牛SLC35A3蛋白质。
更具体地说，本发明涉及检测牛CMV的方法，其中遗传标记是相当于SEQ ID NO18的核苷酸559位置的单核苷酸多态性，所述的单核苷酸多态性是G/T多态性。
本申请还描述了使用等位基因特异性PCR对该多态性进行基因型分类的有效试验。它仅是一组SNPs分类方法中的一种，可采用的其它方法包括，但不限于，微型测序(minisequencing)，引物延伸，热-测序(pyro-sequencing)，PCR-RFLP，等位基因特异性滚动循环扩增，引物延伸接着进行MALDI-TOF质谱术以及各种其它以酶和杂交为基础的方法。
已证实类似于CVM的表型存在于基因lunatic fringe突变的小鼠中(Evrad等，1998)。与患有CVM的牛犊相似，lunaticfringe无效突变纯合的小鼠表现出体节分节和成型改变，具有缩短的身体轴线，椎骨和肋骨融合和未完全形成的脊柱(Evrad等，1998)。Fringe似乎通过调节Notch受体的活性参与边界形成和体节成型的限定(Klein和Arias，1998；Moloney等，2000，Bruckner等，2000)。调节Notch的活性似乎由Fringe的N-乙酰葡糖胺基转移酶活性调节，该酶活性在高尔基体中起动附着到Notch的EGF样序列重复上的O-连接的岩藻糖残基的延长(Moloney等，2000；Bruckner等，2000)。
而且，由于牛SLC35A3基因与人SLC35A3基因同源，因此根据本文提供的信息，在研究人发育缺陷，特别是涉及体节分节和成型的缺陷时分析人SLC35A3基因编码序列的致病性和诊断性突变是显而易见的。
可预期影响N-乙酰葡糖胺从胞质溶胶转运进高尔基体腔的位于高尔基体上的N-乙酰葡糖胺基转运蛋白(SLC35A3)的突变结果会夺去Fringe蛋白质家族的底物。这将影响Fringe调节Notch活性的能力，从而引起类似于CVM的分节缺陷。因此，SLC35A3上的突变除了是CVM的诊断特征外，也是引起该普遍性遗传缺陷的突变似乎非常合理。
在下面的实施例中进一步详细描述本发明
实施例实施例1脊椎畸形综合征(CVM)的遗传图谱本实施例说明了CVM基因座位于牛染色体BTA3上。另外，该实施方案描述了与CVM基因座连锁的标记的鉴定，从而鉴定了牛染色体BTA3的CVM区。
为了定位导致CVM的基因座，从参与育种研究的动物获得样品。简单地说，选择来自公牛T Burma后代且用公牛KOL Nixon的精子授精的大约300头母牛和小母牛用于育种研究。根据Agerholm等，2000所述的死后检查法选择13头患病牛犊。这13头牛犊及其亲代总共28头动物用于起始基因组扫描。牛犊与其共同的祖先，即纯种公牛Carlin-M Ivanhoe Bell间隔4代。
使用从USDA基因组图谱(Kappes等，1997)挑选的一组小随体标记对覆盖所有29对常染色体的基因组进行扫描。在10和20cM之间逐对距离选择标记。在低标记信息的怀疑区，包含且确定了新标记。使用了总共194个标记。在ABI 877 PCR自动仪(Applied Biosystems)中，在含有12ng基因组DNA，1×PCR缓冲液，0.4 U AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)，引物各20pmol和2.0mM MgCl2的5μl体积中以一式两份进行PCR反应。所有标记以相同的接通PCR条件运行94℃温育12分钟以活化酶，以94℃ 30秒；Ta，45秒；72℃，20秒进行35个循环，以72℃最后延伸10分钟结束。前10个循环Ta从67℃下降到58℃，每个循环下降1度，剩下的25个循环Ta固定在58℃。合并PCR产物且在ABI 377(Applied Biosystems)上每个泳道上运行5至9个不同的标记，用所附软件分析凝胶。用Genotyper程序(Version2.1，Applied Biosystems)指定等位基因。
对于3个标记，使用LINKAGE软件包中的MLINK程序(Lathrop等，1985)计算两点优势对数得分。由于谱系结构(图1)具有多个近交回路，因此将谱系分成13个小家族，各患病牛犊的小家族包括雄亲(KOL Nixon)，雌亲和雌亲祖先(T Burma)。假定该疾病是隐性遗传的，具有基因型的完全外显。
发现所有三个标记都明显连锁。用BMS2790和ILSTS029观察到最高优势对数得分(Z)，为Z＝10.35，θ＝0。而且，附近标记INRA003也与CVM基因座明显连锁(表3)。
表3CVM基因座与牛染色体3标记的连锁分析的两点优势对数得分(Z)和重组分散(θ)
根据USDA遗传图谱(Kappes等，1997)，上述结果将CVM基因座定位于BTA3(图2)。
● 11头牛犊 INRA003，BMS2790，ILSTS029，BMS862 和 HUJ246限定的间距是纯合型，而只有BMS2790和ILSTS029在所有13头牛犊中为纯合型，如图1所示。可构建这些标记的单元型，它允许我们推断最可能的CVM单元型(图1)。单元型定义为从1到N编号的标记等位基因的大小，其中1定义为扩增标记的最短等位基因，N定义为最长的等位基因。Bell中与CVM相关的等位基因的实际长度如下INRA003(等位基因编号3)176个碱基对BMS2790(等位基因编号3)118个碱基对ILSTS029(等位基因编号2)164个碱基对BMS862(等位基因编号1)130个碱基对HUJ246(等位基因编号3)262个碱基对等位基因的实际长度取决于扩增标记所用的引物，且上述片断长度以使用表4所述的引物为基础。
另外，本试验包含作为用于遗传缺陷的Danishsurveil-lance程序的一部分被取样的其它17头患病牛犊。所有患病动物具有纯种公牛Bell作为共同的祖先。使用标准方法从血液样品或精液提取DNA。
用跨越BTA3上从大约59.5cM到67.9cM区域的8个标记INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937，和HUJ246对该17头牛犊及其母亲进行基因型确定，且类似于起始育种试验，由于假定另外17头牛犊的CVM基因来源于共同祖先公牛Bell，因此预期血统标记(IBD)的相似区域存在于所有患病牛犊中。结果也是如此在17头牛犊中17头由INRA003和BMS2790定义的染色体片断是纯合型，与来自育种试验的动物具有相同的等位基因。在19头动物中有两头观察到在ILSTS029和BMS862基因座为杂合型，可解释为BMS2790和ILSTS029之间的单个重组事件。因此，根据组合基因型确定的结果，我们发现CVM遗传缺陷很可能位于不超过6cM的间距中，两侧为标记INRA003和ILSTS029，如图2所示，且称为“CVM区”。
8个标记INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937，和HUJ246采用的引物序列在下面表4中描述。
表4
实施例2鉴定CVM携带者的诊断试验通过测定Bell后代是否是疾病相关性单元型的携带者建立了测定CVM牛携带者的诊断试验。
该试验以8个小随体标记INRA003，BMS2790，ILSTS029，BM220，INRA123，BMS862，BMS937和HUJ246为基础，且依赖于对Bell后代动物的疾病特异性等位基因或单元型(见图1)的识别。
因此，如果它们遗传了由来自Bell或来自Bell后代动物的标记INRA003，BMS2790，ILSTS029，和BM220限定的区域中的疾病特异性等位基因，可确定该动物为携带者。如果动物没有遗传来自Bell或来自Bell后代动物的疾病相关性单元型，可确定它们是非携带者。如果Bell单元型被重组分开，该动物命名为不能确定者。只有当由于不能区分母系和父系遗传导致试验标记的信息含量下降时可使用4个其它标记。
与基于连锁DNA标记的所有诊断性遗传试验一样，CVM试验具有不能检测双重重组事件(在病原性基因的每一侧发生一次，发生在基因与侧翼标记之间)的缺点。在本例中，该事件极其稀少，因为标记与CVM基因之间紧密连锁，可估计该试验的可靠性高于99％。
实施例3组织解剖和RNA分离及cDNA合成在分娩3小时内从死产牛犊解剖出大约5克心脏组织，立即在液氮中冷冻并在-80℃下贮存。使用250mg组织用于RNA分离。使用来自Stratagene(目录号200345)的RNA分离试剂盒分离RNA。
通过混合2.5μg总RNA与1μl寡聚(dT)12-18(500μg/ml)，1μl的10mM dNTP混合物和H2O以产生12μl的最终体积来合成cDNA。所得的混合物在65℃下加热5分钟，在冰上冷却并简单旋转。加入4μl的5×第一链缓冲液，2μl的0.1M DTT和1μl的H20之后，混合内容物并在42℃下温育2分钟，随后加入1μl(200 U)的Superscript II(GibcoBRLLifetechnologies)并在42℃下继续温育1.5小时。反应在70℃下灭活15分钟。为了去掉RNA，用1U RNase H(Roche MolecularBiochemicals)在37℃下温育cDNA 20分钟。
实施例4SLC35A3的测序
根据人(homo sapiens)与狗(canis familiaris)之间SLC35A3基因的同源性对比，设计了2个寡聚体(SL1F和SL8R)用于扩增包含起始密码子的牛SLC35A3的几乎完整的cDNA。为了获得该基因的3’端，测序所得的PCR片断并设计了一个新的寡聚体(SL5F)。为了扩增SLC35A3的3’端，根据牛EST的公开序列，使用SL5F与寡聚体(bSLCBVIR)的组合。
对于两个引物组采用相同的PCR条件。
在GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)中在由1μl 10xNH4反应缓冲液，0.5μl 50mM MgCl2，0.8μl dNTPs(各2.5mM)，5.65μl H2O，1μl正向和反向引物(各5pmol)和0.05μl5 U/μl BIOTAQ DNA聚合酶(Bioline)组成的10μl最终体积中进行PCR反应。
运行的PCR反应由95℃ 2分钟的起始热激活步骤及随后10个循环的95℃变性30秒，62℃退火30秒(下降0.5℃)，和72℃延伸20秒，加上另外30个循环的95℃ 30秒的变性步骤，57℃的退火温度30秒和72℃ 30秒的延伸步骤组成。
下列引物用于扩增完整的SLC35A3 cDNASL1F5’-GGA GGC AAA TGA AGA TAA AAC-3’(SEQID NO19)SL8R5’-CTA TGC TTT AGT GGG ATT3-’(SEQ ID NO20)SL5F5’-GAG TTG CTT TTG TAC AGT GG-3’(SEQ ID NO21)bSLCBVIR5’-ACT GGC TAC TAT CTA GCA CAG GA-3’(SEQ ID NO22)使用纯化的PCR产物作模板通过采用这些引物在4个独立的循环测序反应中获得了完整的cDNA序列。使用SPIN-X(Corning公司)从0.8％ Seakem琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。
循环测序反应在GeneAmpPCR System 9700(AppliedBiosystems)中进行且包括96℃ 2分钟的起始步骤，接着99个循环的96℃ 10秒，55℃ 5秒和60℃ 4分钟。测序产物用2倍体积的乙醇和1/10体积的3 M NaAc(pH 5.5)沉淀，用70％的乙醇洗涤，重悬于5μl上样缓冲液中并使用ABI377自动测序仪在4％丙烯酰胺测序凝胶上运行。
牛SLC35A3的cDNA序列在图4中显示(SEQ ID NO18)。
实施例5含小随体标记的BACs的鉴定和分离滤膜杂交滤膜在杂交溶液[6xSSC(每升含52.6g NaCl，26.46g柠檬酸钠)]，5x Denhardt[2g Ficoll(400型，Pharmacia)]，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白(Fraction V，Sigma)，0.5％ SDS和50μg/ml SS-DNA)中65℃下转动预杂交3小时。然后将100μl5’-端标记的寡核苷酸与该滤膜在65℃下温育16小时。至于末端标记，将5pmol的寡核苷酸与5μl(50μ Ci)的γ-32P-ATP(比活＞5000Ci/mmole)，2μl 10x激酶缓冲液，11μl H2O和1μl(10U)的T4多核苷酸激酶(New England Biolabs Inc.)混合，混合物在37℃下温育1.5小时，接着煮沸5分钟以便热灭活酶。使用标准方法以NaAc/乙醇沉淀标记探针，在70％乙醇中洗涤一次后，探针重新溶解于100μl的H2O中。杂交后，用洗涤溶液I(2xSSC，0.2％ SDS)洗涤滤膜一次，用洗涤溶液II(0.1xSSC，0.5％ SDS)在65℃下洗涤两次，并在-80℃下对柯达BIOMAXTM MS胶片曝光2天。
使用下列5’-端标记的寡核苷酸鉴定ILSTS029和INRA003阳性BAG克隆ILSTS029寡聚体5’-CAC ACC GCT GTA CAG GAA AAA GTG TGCCAA CCC TGG TCT AAA TCC AAA ATC CAT TATCTT CCA AGT ACA T-3’(SEQ ID NO23)INRA003寡聚体5’-CGT CCC CTA TGC GCT TAC TAC ATA CACTCA AAT GGA AAT GGG AAA ACT GGA GGT GTGTGA GCC CCA TTT A-3’(SEQ ID NO24)牛BAC文库的PGR筛选从BAC文库制备BAC库并通过PCR筛选。在GeneAmpPCRSystem 9700(Applied Biosystems)中在由1μl 10xNH4反应缓冲液，0.5μl 50mM MgCl2，0.8μl dNTPs(各2.5mM)，5.65μlH2O，1μl正向和反向引物(各5pmol)和0.05μl 5U/μl BIOTAQDNA聚合酶(Bioline)组成的10μl最终体积中进行PCR反应。
使用下列引物通过PCR鉴定含有BMS2790的BAC克隆BMS2790F5’-AAG ACA AGG ACT TTC AGC CC-3’(SEQ ID NO25)BMS2790R5’-AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C-3’(SEQ ID NO26)运行的PCR反应由95℃ 2分钟的起始热激活步骤及随后10个循环的95℃变性30秒，70℃退火30秒(下降0.5℃)，和72℃延伸20秒，加上另外30个循环的95℃ 30秒的变性步骤，65℃退火30秒和72℃延伸20秒组成。
BAC DNA的分离和测序按照Qiagens Large Construct试剂盒制备BAC DNA，使用大约1μg的BAC DNA作为循环测序的模板，测序用BigDyelM终止子循环测序试剂盒(PE Applied Biosystems)进行。循环测序反应在含有1μl Big DyeTM终止子混合物，1μl引物(5pmol)，1μl反应缓冲液和2μl H2O的6μl最终体积中进行。循环测序反应在GeneAmpPCR System 9700(Applied Biosystems)中进行且包括96℃ 2分钟的起始步骤，接着130个循环的96℃ 10秒，55℃ 5秒和60℃ 4分钟。测序产物用2倍体积的乙醇和1/10体积的3 M NaAc(pH 5.5)沉淀，用70％的乙醇洗涤，重悬于2μl上样缓冲液中并使用ABI377自动测序仪在4％丙烯酰胺测序凝胶上运行。
测序引物T75’-TTA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’(SEQ ID NO27)SP65’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’(SEQ ID NO28)INRA003F5’-CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA-3’(SEQ ID NO29)INRA003R5’-CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG-3’(SEQ ID NO30)实施例6通过测序确定CVM状态
使用Primus HT(MWG Biotech AG)在96孔平板中无油条件下进行PCR反应(2μl纯化的模板/样品基因组DNA，2μl 10xPCR缓冲液，2μl 25mM MgCl2，3.3μl各0.2mM的dNTP(UltrapuredNTP，27-2033-01；Amersham Pharmacia Biotech)，6pmol引物(正向CBFEX1，5’-GGC CCT CAG ATT CTC-3’(SEQ ID NO31)；反向CBTEXR，5’-GTT GAA TGT TTC TTA-3’)(SEQ ID NO32)，0.165 U Taq聚合酶(Biotaq，M95801B；Bioline)，加dH2O至总体积)。循环条件95℃ 120秒，35x[95℃ 60秒，60℃ 30秒，72℃ 110秒]。通过使用Sephadex G-50 Superfine(17-0041-01，Amersham Pharmac ia Biotech)按照产品介绍进行的凝胶过滤(Millipore Filtration System)实现反应后的纯化，对于最终样品洗脱液使用50μl的dH2O。正向和反向测序反应使用与产生PCR产物所用的引物相同的引物进行(2μl PCR产物，8μl测序混合物，0.6μl 6pmol引物(见上文)，加dH20至20μl；DYEnamic ETDye终止子循环测序试剂盒(US81095))。热循环(30x[95℃ 20秒，55℃ 15秒，60℃ 70秒])后，基本上如上所述通过凝胶过滤纯化样品并使用LPA long-read模型和如下测序条件即在3kV下注射90秒和在9kV下电泳35分钟，在MegaBACE1000(AmershamPharmacia Biotech)上分析。
实施例7等位基因特异性PCR试验从cDNA序列设计引物且4个等位基因特异性引物设计成在突变位置具有3’碱基。
引物序列T_fwd5’-CAG TGG CCC TCA GAT TCT CAA GAG CTT AAT TCTAAG GAA CTT TCA GCT GGC TCA CAA TTT GTA GGT CTCATG GCA T-3’(SEQ ID NO33)G_fwd5’-CAC AAT TTG TAG GTC TCA TGG CAG-3’(SEQ ID NO34)A_rev5’-GCC ACT GGA AAA ACA TGC TGT GAG AAA-3’(SEQ ID NO35)C_rev_link*5’-aat gct act act att agt aga att gatgcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aatgaa aat ata gct aaa cag gtt att gac catttg cga aat gta tct aat ggt caa actttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GAA C-3’(SEQ ID NO36)Fwd5’-GGC CCT CAG ATT CTC AAG AGC-3’(SEQ ID NO37)Rev5’-CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG-3’(SEQ ID NO38)C_rev_link引物含有M13噬菌体的接头序列(以小写字母表示)。加入该接头可获得更长的PCR产物以便能够在一个PCR反应中多重反应C-和A-引物。突变位置的3’碱基以黑体字表示。C-和G-引物对野生型等位基因是特异性的，而T-和A-特异性引物对突变是特异性的。
引物对C-和A-特异性多重反应Fwd+A_rev+C_rev_link(下链)
T-特异性反应T_fwd+Rev(上链)G-特异性反应G_fwd+Rev(上链)AS-PCR条件在含有20-100ng基因组DNA，0.025单位/μl BIOLASEDiamond DNA聚合酶，0.75mM dNTPs，3mM MgCl2，溶于1x NH4缓冲液(Bioline)中的0.25pmol/μl引物(在多重反应中两个反向引物为0.125pmol/μl)的10μl体积中进行各PCR反应。在如下条件下在GeneAmpPCR System 9700(PE Applied Biosystems)中进行PCR95℃ 4分钟，35个循环的94℃ 30秒，62℃(对于T-和G-反应为56℃)以80％的坡度处理30秒，及72℃ 30秒，接着72℃下最后延伸7分钟并在4℃下贮存。PCR后在2％琼脂糖凝胶中以200V电泳30分钟。
两个野生型，两个携带者，和两个患病动物的等位基因特异性PCR分析的结果在图7中显示。
图1显示了用于定位牛脊椎畸形综合征(CVM)基因座和牛染色体3上的5个小随体标记的单元型的谱系。最可能的CVM单元型以黑体表示。实心黑框表示患病牛犊。雄亲和雌亲之间的双线表示近交回路。N表示动物数目。13个不同雌亲的基因型为了简明而未显示。
图2显示了牛染色体3的遗传图谱。旁边的数字是指沿染色体以厘摩(cM)给出的遗传距离。表示了牛脊椎畸形综合征(CVM)基因座最可能的位置。
图3显示了按美国肉类动物研究中心(Kappes等，1997)描绘的牛3号染色体上3个小随体标记ILSTS029，BMS2790和INRA003(在线上显示，表示为牛3号染色体上的连续标记)之间以cM表示的相对距离。通过与高密度复制滤膜杂交(ILSTS029和INRA003)，或者通过PCR筛选RPCI-42牛BAC文库(BMS2790)分离含有这3个标记的BACs。鉴定的BACs以黑色线段表示且注明平板号/孔号。使用SP6和T7引物对这些BACs进行末端测序或者使用从小随体延伸的引物进行测序。使用Sanger中心的Ensemble服务器将所得的序列对人1号染色体进行blast检索。来自blast检索的登录号在人1号染色体下面以登录号表示且命中者之间的相对距离以MB给出。该区域中的选定基因以方框表示。
图4显示了SLC35A3基因(SEQ ID NO18)的cDNA序列和翻译及其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO17)。位置559上的多态性核苷酸和受影响的缬氨酸-180以黑体字表示。
图5显示了奶牛SLC35A3推断的氨基酸序列与人(AB021981)(Ishida等，1999)和狗(AF057365)(Guillen等，1998)序列的比较。点表示与Bos Taurus序列匹配的残基。破折号表示为优化序列对比而插入的间隔。
图6显示了通过测序确定CVM状态时在559位置显示G/T多态性的区域(SLC35A3的核苷酸544至572，见图4)的测序结果。左右组分别显示了正向和反向测序。上排(-/-)显示了对野生型动物的测序，中排显示了对携带者(杂合型)的测序，下排显示了对患病动物的测序。
图7是显示来自两个野生型，两个携带者和两个患病动物的等位基因特异性PCR产物的照片。注解WT野生型，C携带者，S患病者，neg阴性对照，M标记(大小梯度)。箭头显示了等位基因特异性PCR产物C220bp，A98bp，T；340bp，和G288bp。
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<223>DNA引物<400>1ctggaggtgt gtgagcccca ttta24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>2ctaagagtcg aaggtgtgac tagg24
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>3aagacaagga ctttcagccc 20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>4aaagagtcgg acattactga gc 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>5tgttttgatg gaacacagcc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>6tggatttaga ccagggttgg 20<210>7<211>20
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<220>
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<223>DNA引物
<400>15gtagccatgg agactggact g 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>16cattatcccc tgtcacacac c 21<210>17<211>326<212>PRT<213>牛SLC35A3蛋白<220>
<223>DNA引物<400>17Met Ser Ala Asn Leu Lys Tyr Leu Ser Leu Gly Ile Leu Val Phe Gln15 10 15Thr Thr Ser Leu Val Leu Thr Met Arg Tyr Ser Arg Thr Leu Lys Glu20 25 30Glu Gly pro Arg Tyr Leu Ser Ser Thr Ala Val Val Val Ala Glu Leu35 40 45Leu Lys Ile Met Ala Cys Ile Leu Leu Val Tyr Lys Asp Ser Lys Cys50 55 60Ser Leu Arg Ala Leu Asn Arg Ile Leu His Asp Glu Ile Leu Asn Lys65 70 75 80Pro Met Glu Thr Leu Lys Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Tyr Thr Leu85 90 95Gln Asn Asn Leu Leu Tyr Val Ala Leu Ser Asn Leu Asp Ala Ala Thr100 105 110Tyr Gln Val Thr Tyr Gln Leu Lys Ile Leu Thr Thr Ala Leu Phe Ser115 120 125Val Ser Met Leu Ser Lys Lys Leu Gly Val Tyr Gln Trp Leu Ser Leu130 135 140Val Ile Leu Met Thr Gly Val Ala Phe Val Gln Trp Pro Ser Asp Ser145 150 155 160Gln Glu Leu Asn Ser Lys Glu Leu Ser Ala Gly Ser Gln Phe Val Gly165 170 175Leu Met Ala Val Leu Thr Ala Cys Phe Ser Ser Gly Phe Ala Gly Val180 185 190
Tyr Phe Glu Lys Ile Leu Lys Glu Thr Lys Gln Ser Val Trp Ile Arg195 200 205Asn Ile Gln Leu Gly Phe Phe Gly Ser Ile Phe Gly Leu Met Gly Val210 215 220Tyr Val Tyr Asp Gly Glu Leu Val Ser Lys Asn Gly Phe Phe Gln Gly225 230 235 240Tyr Asn Arg Leu Thr Trp Ile Val val Val Leu Gln Ala Leu Gly Gly245 250 255Leu Val Ile Ala Ala val Ile Lys Tyr Ala Asp Asn Ile Leu Lys Gly260 265 270Phe Ala Thr Ser Leu Ser Ile Ile Leu Ser Thr Leu Ile Ser Tyr Phe275 280 285Trp Leu Gln Asp Phe Val Pro Thr Ser Val Phe Phe Leu Gly Ala Ile290 295 300Leu Val Ile Thr Ala Thr Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Pro Lys Pro Ala305 310 315 320Gly Asn Pro Thr Lys Ala325<210>18<211>1217<212>DNA<213>牛SLC35A3 cDNA<220>
<223>DNA引物<400>18caggcaaatg aagataaaac aatgtcagcc aacctaaaat acctttcttt aggaattttg 60gtctttcaga ctaccagttt ggttctgacg atgcgttatt ctaggacatt aaaagaagag 120gggcctcgtt atctgtcatc tacagctgtg gttgttgctg aacttttgaa gataatggcc 180tgcattttat tagtctacaa agatagcaaa tgtagtctaa gagcactgaa tcgaatacta 240catgatgaaa ttcttaataa acctatggaa acgcttaaac ttgctattcc atcagggata 300tatactcttc agaataattt actctatgtg gcactgtcaa atctcgatgc agctacttat 360caggtcacat atcagttgaa aattcttaca actgcactat tttctgtgtc aatgcttagt 420aaaaaattag gtgtgtacca gtggctctcc ctagtaattt tgatgacagg agttgctttt 480gtacagtggc cctcagattc tcaagagctt aattctaagg aactttcagc tggctcacaa 540tttgtaggtc tcatggcagt tctcacagca tgtttttcca gtggctttgc tggggtttac 600tttgagaaaa tcttaaaaga aaccaaacaa tcagtgtgga taagaaacat tcaacttggt 660ttctttggga gtatatttgg attaatgggt gtatatgttt atgatggaga actggtatca 720aagaatgggt tttttcaggg atataaccga ctgacctgga tagttgttgt tcttcaggca 780ctgggaggcc ttgtaatagc tgctgttatt aagtatgcgg ataacatttt gaaaggattt 840gcaacctctt tgtccataat attatcaaca ctaatatctt atttttggct acaagatttt 900gtaccaacca gtgtcttttt ccttggagcc atccttgtaa taacagctac tttcctatat 960ggttatgatc ccaaacctgc aggaaatccc actaaagcat agtggtaact tacctggttt 1020ttcacagtgg tgcactggga atctcaacat taatgctgca cagaggactt ctacagattc 1080
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<223>DNA引物<400>19ggaggcaaat gaagataaaa c 21<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>DNA引物<400>23cacaccgctg tacaggaaaa agtgtgccaa ccctggtcta aatccaaaat ccattatctt 60ccaagtacat 70<210>24<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>24cgtcccctat gcgcttacta catacactca aatggaaatg ggaaaactgg aggtgtgtga 60gccccattta 70<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>25aagacaagga ctttcagccc 20<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>26aaagagtcgg acattactga gc 22
<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>27ttatacgact cactataggg 20<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>28atttaggtga cactatag 18<210>29<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>29ctggaggtgt gtgagcccca ttta24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>30ctaagagtcg aaggtgtgac tag 24<210>31<211>15<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>31ggccctcaga ttctc 15<210>32<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>32gttgaatgtt tctta 15<210>33<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>33cagtggccct cagattctca agagcttaat tctaaggaac tttcagctgg ctcacaattt 60gtaggtctca tggcat 76<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>34cacaatttgt aggtctcatg gcag24<210>35<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>DNA引物<400>35gccactggaa aaacatgctg tgagaaa 27<210>36<211>139<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>36aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac ttttttctgg 120aaaaacatgc tgtgagaac 139<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>37ggccctcaga ttctcaagag c 21<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA引物<400>38cgatgaaaaa ggaaccaaaa ggg 2权利要求
1.检测牛受试者中牛脊椎畸形综合征(CVM)的方法，其中鉴定存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的遗传标记，所述的方法包括a)提供牛遗传物质，和b)在所述的遗传物质中检测是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的至少一个遗传标记。
2.根据权利要求1的方法，其中至少一个遗传标记位于牛染色体BTA3上。
3.根据权利要求2的方法，其中所述的至少一个遗传标记位于两侧为多态性小随体标记BM4129和BMS1266且包含它们的区域中。
4.根据权利要求3的方法，其中至少一个遗传标记位于从大约59.5cM到大约67.9cM的区域中。
5.根据权利要求4的方法，其中至少一个遗传标记位于两侧为多态性小随体标记INRAA003和BMS937且包含它们的区域中。
6.根据权利要求5的方法，其中至少一个遗传标记位于两侧为多态性小随体标记INRAA003和ILSTS029且包含它们的区域中。
7.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记INRAA003。
8.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记BMS2790。
9.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记ILSTS029。
10.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记INRA123。
11.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记BM220。
12.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记HUJ246。
13.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记BMS862。
14.根据权利要求2的方法，其中至少一个遗传标记是小随体标记BMS937。
15.根据权利要求1的方法，其中至少一个遗传标记与引起牛脊椎畸形综合征疾病的基因连锁。
16.根据权利要求15的方法，其中引起牛脊椎畸形综合征疾病的基因是牛SLC35A3基因。
17.根据权利要求16的方法，其中牛SLC35A3基因编码包含SEQ ID NO17所示的氨基酸序列的牛SLC35A3蛋白质。
18.根据权利要求17的方法，其中牛SLC35A3蛋白质由包含SEQ ID NO18的核苷酸序列的cDNA序列编码。
19.根据权利要求18的方法，其中遗传标记是相当于SEQ IDNO18的核苷酸559位置的单核苷酸多态性。
20.根据权利要求19的方法，其中单核苷酸多态性是G/T多态性。
21.根据权利要求20的方法，其中通过选自由等位基因特异性PCR，微型测序，引物延伸，热-测序，PCR-RFLP，等位基因特异性滚动循环扩增和引物延伸接着进行MALDI-TOF质谱术组成的组中的一种技术进行G/T多态性检测。
22.根据权利要求2的方法，其中所述的至少一个遗传标记与引起牛脊椎畸形综合征疾病的基因或疾病性状在遗传上连锁，其优势对数得分为至少3.0，例如至少4.0，包括至少5.0，例如至少6.0，包括至少7.0，例如至少8.0，包括至少9.0，例如至少10.0，包括至少11.0，例如至少12.0。
23.根据权利要求1的方法，其中至少一个标记是遗传标记的组合。
24.根据权利要求7的方法，其中用于扩增小随体标记INRAA003的引物对是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
25.根据权利要求8的方法，其中用于扩增小随体标记BMS2790的引物对是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
26.根据权利要求9的方法，其中用于扩增小随体标记ILSTS029的引物对是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
27.根据权利要求10的方法，其中用于扩增小随体标记INRA123的引物对是SEQ ID NO7和SEQ ID NO8。
28.根据权利要求11的方法，其中用于扩增小随体标记BM2 20的引物对是SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。
29.根据权利要求12的方法，其中用于扩增小随体标记HUJ246的引物对是SEQ ID NO11和SEQ ID NO12。
30.根据权利要求13的方法，其中用于扩增小随体标记BMS862的引物对是SEQ ID NO13和SEQ ID NO14。
3 1、根据权利要求14的方法，其中用于扩增小随体标记BMS937的引物对是SEQ ID NO15和SEQ ID NO16。
32.用于检测牛受试者中存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的至少一个遗传标记的诊断试剂盒，包含选自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38，及其组合组成的组中的至少一个寡核苷酸序列。
全文摘要
本发明描述了用于鉴定脊椎畸形综合征(CVM)疾病基因的牛携带者的遗传标记。该遗传标记包括小随体标记BM4129，INRAA003，BMS2790，ILSTS029，INRA123，BM220，HUJ246，BMS862，BMS937，BL1048，BMS2095和BMS1266以及牛SLC35A3基因，它们位于牛染色体BTA3上。牛SLC35A3基因559位的G/T多态性被鉴定为牛CVM的病因和诊断特征。
文档编号C12Q1/68GK1503847SQ01821716
公开日2004年6月9日 申请日期2001年11月15日 优先权日2000年11月16日
发明者克里斯蒂安·本迪克森, 瑟伦·斯文森, 黑勒·延森, 弗兰克·帕尼茨, 安德斯·奥斯博格, 拉尔斯-埃里克·霍尔姆, 佩尔·霍恩, 阿内特依·霍伊, 博·汤姆森, 梅特·耶珀森, 维维·胡尼科克·尼尔森, 马蕾·琼克, 奥斯博格, 帕尼茨, 依 霍伊, 克里斯蒂安 本迪克森, -埃里克 霍尔姆, 姆森, 延森, 斯文森, 琼克, 耶珀森, 胡尼科克 尼尔森, 霍恩 申请人:丹麦粮食、农业、渔业部农业科学研究院, 丹麦畜牧协会, 丹麦粮食、农业、渔业部农业科学研究