专利名称：含抗体乳的除菌方法以及含有除菌处理后的含抗体乳的制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及含抗体乳的除菌方法，以及含有通过该方法除菌后的含抗体乳的免疫赋活剂以及食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品。
背景技术：
含抗体乳(又称为“免疫乳”)，例如在涉及抑制胃肠道的混合细菌感染的特开昭54-113425号公报，或在涉及抗炎剂的特开昭57-188523号公报中公开的那样，是给牛接种由26种细菌制造的疫苗使之免疫后由牛乳制造的物质，是无限接近于人的母乳的自然食品。
众所周知所述含抗体乳中以高活性状态含有将人易感染的多种细菌无害化的抗体成分和抗炎因子等功能性成分，因此对于风湿、高血压、高胆固醇、变态反应、便秘等有效，能够增强老年人和癌症患者等的免疫力。
另外，也在讨论口服摄取含抗体乳预防轮状病毒感染的可能性。据说口服给予抗轮状病毒抗体对于预防病毒感染有效，而且抗体具有高抗体效价和中和活性时，也可以期待某种程度的治疗效果。(T.Ebina等，Med.Microbiol.Immunol.，174，177(1985)；H.Hilpert等，J.Infect.Dis.，156，158(1987))而且，最近本申请的发明人之一铃木等提示通过用免疫的6种肠道病毒(CVA9、CVA16、CVB3、CVB5、E11和E18)中，特别是众所周知由病毒引发心肌炎、心房心肌炎的CVB3的抗原进行免疫得到的含抗体乳被动免疫，能够提高肠道粘膜的防御功能(铃木等，“感染症学杂志(The Journal of the Japanese Association for InfectiousDiseases)”，第73卷第2号，第122～129页(1998))。
如上所述，含抗体乳对于预防或治疗各种疾病具有很大的可能性。但是，多数情况下挤奶得到的含抗体乳中含有杂菌，因此不能直接饮用或添加到各种食品中，与一般的牛乳制造中所负有的义务同样，必须进行灭菌或除菌处理。
这时，考虑适用一般的牛乳制造中使用的加热灭菌法。但是，根据考察加热灭菌后乳中抗体活性消失的结果，采用63℃、30分钟低温灭菌(保持灭菌)法，抗体活性减少到6～8成，而且如果采用130℃、2秒以上的超高温灭菌法(通常市售的牛乳的灭菌处理法；ultra-hightemperature heating“UHT”)，抗体活性完全失活。因此，加热灭菌后将含抗体乳用于饮料等时，不得不采用低温灭菌法(特开平4-66050号公报；大田宾，“化学与生物(Kagaku to Seibutsu)”37(2)，107-112(1999))。
但是，采用低温灭菌法未必可以说是能够充分灭菌，恐怕残留的菌会繁殖，因此在保存性方面存在难点，另外还存在约内氏病(Johne’sdisease)等公共卫生方面的问题。
因此，讨论适用不需要加热的过滤除菌法。作为除菌对象的菌体的大小为1～5μm。但是，即使使用筛分滤器型的孔径为1μm以下的膜滤器，也不能充分除菌，另一方面，如果使滤器的孔径更小，则堵塞问题变得严重，在实用方面存在问题。
因此，需要开发一种新型过滤除菌法，其抗体的透过率优良，另一方面满足既能够完全除菌又能够防止滤器堵塞两方面要求。
发明公开本发明的目的在于提供一种过滤除菌的方法，能够保持含抗体乳的抗体活性，同时能够有效地过滤除去乳中的杂菌，达到近似无菌的状态。
另外，本发明的课题在于提供一种以在保持抗体活性的同时除菌后的含抗体乳作为有效成分的免疫赋活剂，以及添加了含抗体乳的食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品。
本发明人等不仅悉心研究了用于过滤除菌的滤器的孔径，而且也悉心研究了滤器层的结构等，结果发现通过使用特定微孔滤器的过滤除菌法，能够得到与加热灭菌几乎同等水平的无菌或近似无菌的含抗体乳，从而完成了本发明。
也就是说，本发明涉及含抗体乳的除菌方法，其特征在于，从用选自病原体或其代谢产物的1种或2种以上抗原致敏使体内产生抗体的牛科动物挤取的含抗体乳的除菌处理中，进行脱脂处理后，使用陶瓷微粒形成的，包括具有滤孔且厚度为40～150μm的滤膜以及支撑体的微孔滤器进行过滤。
另外，本发明还涉及上述除菌方法，其特征在于，陶瓷微粒的平均粒径为0.2～2.0μm，滤孔的平均孔径为0.4～2.0μm，上述微孔滤器采用交叉流动方式。
另外，本发明还涉及上述除菌方法，其中，微孔滤器是SteriloxMF(法国Societe des Ceramiques Techniques公司的商标)。
另外，本发明还涉及上述除菌方法，其中，病原体是引发消化系统或呼吸系统疾病的细菌或病毒。
而且，本发明还涉及免疫赋活剂，其中含有采用上述方法除菌处理后的含抗体乳作为有效成分。
另外，本发明还涉及食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品，其中含有采用上述方法除菌处理后的含抗体乳。
以下，详细说明本发明。
(1)含抗体乳是从以细菌、病毒、真菌、立克次氏体等病原体(特别是消化系统和呼吸系统的感染性细菌、病毒)及其代谢产物作为抗原，促升给予(booster dose；追加抗原给予)后的雌性牛科动物挤取的乳。
作为所述含抗体乳，优选将疫苗给予雌性牛科动物使之致敏后，以致敏细菌或病毒及其代谢产物作为抗原，给予充分量，然后由该动物挤取的乳。
本发明中，作为使雌性牛等致敏的抗原，可以例举使诱发感染症的细菌或病毒等病原体本身、以及这些病原体的代谢产物等的1种或2种以上无害化(失活)得到的疫苗。
其中，作为形成抗原的细菌，可以例举金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌A型、产气菌、大肠菌、肠炎菌、绿脓杆菌、肺炎杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿色链球菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、链球菌B群、肺炎双球菌、变异链球菌、痤疮菌等。
另外，作为病毒，可以例举肠道病毒、轮状病毒、口蹄疫(手足口病)病毒、流感病毒等，但是在本发明中并不限于此，而且也不限于各种病毒的任何一种类型。
另外，作为用含有上述所有细菌性和病毒性抗原的抗原制作的多效疫苗免疫的雌性牛科动物，可以例举牛、山羊和羊等，没有特别的限定。
作为抗原给予的细菌性抗原量通常为1×106～1×1020个，优选108～1010个。
用于免疫的病毒量为0.001mg～100mg/1次，优选0.1mg～10mg/1次。
本发明的免疫可以按照常规方法进行。免疫一般通过间隔给定的时间将给定量的抗原注射到牛科动物的适当部位进行。间隔给定的免疫间隔，进行部分采血，测定抗体的效价，同时继续免疫达到所需的效价，在抗体达到所需的效价后结束免疫。另外，为了提高抗体效价，有必要反复给予抗原获得追加免疫，上述免疫间隔是指为了所述追加免疫给予抗原的间隔。
从如上所述使体内产生抗体后的牛科动物挤取的乳(含抗体乳)根据需要除去对人体显示毒性活性的细菌性毒素或者进行解毒。
细菌性毒素，特别是发热性毒素，由脂多糖(LPS)代表的来源于革兰氏阴性细菌的内毒素(endotoxin)以及超级抗原代表的来源于革兰氏阳性细菌的外毒素构成。
这些细菌性毒素是食物中毒或发热等的原因，而且严重的情况下有时会导致患者休克或死亡。
内毒素大致能够通过用反渗透膜或超滤膜过滤除去，但是由于内毒素与抗体的分离困难，一般情况下膜过滤法不适用于含抗体乳。
另一方面，作为通过吸附除去内毒素的方法，只要是使六亚甲基二异氰酸酯与固定有多粘菌素B等抗生素的纤维交联琼脂糖珠粒反应得到的珠粒(特开平4-114661号公报；东レ社制“トレミキシソ”)、固定有组氨酸或其衍生物的材料(例如，氨基酸、亚氨基二乙酸、含氮杂环化合物(特开昭54-183172号公报等))以及透明质酸和阴离子树脂构成的材料(特开昭54-67024号公报)等含有以前公知的化合物等吸附来源于革兰氏阴性细菌的内毒素的材料，没有特别的限定，均可以用于吸附毒素。
来源于革兰氏阳性细菌的外毒素已知金黄色葡萄球菌的外毒素(肠毒素A、B、C或中毒性休克综合症毒素-1)等。作为其特征，多为分泌型的蛋白质性外毒素。只要是含有带脲键或硫脲键的化合物(特开平10-85330号公报，特开平10-147533号公报，特开平10-225515号公报)等以前公知的化合物，吸附来源于革兰氏阳性细菌的外毒素的吸附结构，没有特别的限定，均可用作这些外毒素的吸附结构。
(2)脱脂处理挤取的含抗体乳中的脂肪球径分布通常为0.1～22μm，平均为3μm。另一方面，作为除菌对象的杂菌的菌体大小如上所述通常为1～5μm，因此与脂肪球大小几乎相同。因此，使用滤膜根据大小进行分离很困难，因而作为采用微孔滤器的精密过滤处理的前阶段，有必要进行脱脂处理，例如使用离心分离机根据比重的差异分离脂肪球与乳中的抗体或酪蛋白(0.04～0.3μm)。
(3)过滤除菌处理使用下述特定的微孔滤器，对通过上述脱脂处理得到的乳脂肪成分0.1％以下的脱脂乳进行过滤除菌，制造除菌后的含抗体乳。
微孔滤器，包括支撑滤膜的支撑体，整体由氧化铝等陶瓷制。其滤器部分是陶瓷微粒凝集形成，且具有滤孔的厚度为40～150μm，优选60～100μm的滤膜。这种厚度的滤膜可以通过将2张或3张以上厚度薄的滤膜层压制作。
该微孔滤器优选供给液(浓缩液)流动的方向与透过液流动的方向正交的方式，即所谓交叉流动(十字流)方式。
在既能提高除菌率又能防止堵塞的方面，微孔滤器的陶瓷微粒的平均粒径优选为0.2～2.0μm，特别优选0.4～1.8μm，滤器的平均孔径优选为0.4～2.0μm，特别优选0.8～1.6μm。
作为满足所述条件的微孔滤器，有法国Societe des CeramiquesTechniques(简称SCT)公司制造的“Sterilox MF(商标)”，可以购入使用。
适于本发明方法的微孔滤器的结构例如如图1所示。
图1是也能表示内部结构的微孔滤器的部分截面侧视图以及滤膜的截面结构的放大图。微孔滤器(1)具备多根沿箭头方向流动的供给液的流路(4)，各流路(4)周围的界面由滤膜层(2)以及支撑它的网眼稀疏的陶瓷制支撑体(3)构成，滤膜层(2)通过将由非常细小的陶瓷微粒形成且具有滤孔的滤膜第2层(2a)和滤膜第1层(2b)层压得到。流路(4)中流入的含抗体乳(6)中抗体和酪蛋白通过滤膜(2)，另一方面，含有大量杂菌的浓缩液(5)直接被排出，分离杂菌。另外，也可以循环对浓缩液进行再次过滤。
杂菌的菌体大小通常为1～5μm，由于滤膜的空隙不一致，且其厚度为40～150μm，因此即使是比滤孔小的杂菌也不能通过滤器，可以从含抗体乳中分离出来。
而且，如果使用交叉流动型滤器，使乳沿着滤膜的表面平行地高速流动，分离成通过膜的透过液和不通过膜而浓缩的浓缩液，则能够防止杂菌引起微的孔滤器堵塞，除菌效率高，而且能够进行长时间稳定的过滤除菌处理。
图2是表示过滤除菌处理的一个实例的流程图。也就是说，含抗体乳从原乳罐(11)通过泵(12)经由热交换器(13)加热至适当的分离温度后，输送至离心分离机(14)，分离成脂肪成分和脱脂乳。接着，脱脂乳通过泵(15)经由热交换器(16)加热至适当的分离温度，通过泵(17)输送至微孔滤器(18)。通过滤膜的透过液是除去了杂菌的乳。另一方面，未通过膜的浓缩液是含杂菌多的乳。
采用交叉流动方式过滤的场合，乳透过滤膜的力是透过液侧的压力与浓缩液侧的压力的压差(trans-membrane pressure)引起的，这会使膜整体产生压力损失。根据经验已知采用低压差运转时能够导致膜的堵塞延迟等优良的性能。因此，使用交叉流动方式的微孔滤器时，为了使膜整体以最适条件进行运转，通常优选用小的塑料球填充作为空洞的透过液侧的通路，并用泵调整透过液侧的压力，使过滤膜的外侧象浓缩液侧那样以平行流高度循环，通过微孔滤器的全部流路使浓缩液侧的压力与透过液侧的压力的差(压差)达到一定，通过“一定压差(uniform trans-membrane pressureUTP)”使过滤装置运转。
另外，已知微粒或微生物等多种物质在水中浸渍时具有特有的ζ电位(界面动电势)，因此也可以使微孔滤器成为具有ζ电位的滤器，同时利用电吸附效果。
作为微孔滤器过滤步骤，可以适当选择将含抗体乳用微孔滤器仅过滤1次的方法、将通过微孔滤器的透过液用微孔滤器再过滤1次或数次的方法、使浓缩液返回至原料侧再次循环至微孔滤器的方法等通常用微孔滤器处理的方法。
希望维持高除菌率的场合，可以通过反复过滤实现这一目的。
除菌过滤处理时乳的温度优选为40～55℃，特别优选为45～50℃。这是因为通过将乳加热，脂肪球容易变形，从而容易透过。加热低于40℃时，上述效果少，超过55℃时恐怕会导致成分的变化，因此希望在加热进行微孔滤器处理后，尽可能迅速地将透过液冷却。
另外，过滤除菌后的含抗体乳可以通过制成粉末，在保持高抗体效价的同时，长时间保存，例如1年以上。
作为粉末化的方法，优选不进行加热处理的冷冻干燥(FD)法或50℃以下的减压喷雾干燥法，这样不会使抗体效价降低。
通过将这样得到的液状或粉状的过滤除菌后的含抗体乳适当添加混合在各种原料中，可以制造免疫赋活剂以及带有抗体的食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品。
(4)免疫赋活剂本发明的免疫赋活剂可以适用于预防、治疗或缓解感染症。作为免疫赋活剂的剂型，可以采用药品领域公知的任意形态。例如，除液体制剂以外，还可以制成片剂、胶囊(如果是显示肠溶性的材料，则更优选)粉末、溶胶、凝胶、颗粒和用脂质体包合等剂型。
制成各种制剂时，能够以药学上允许的量使用本领域技术人员公知的各种赋形剂或添加剂等。根据其形态和制剂形态等，可以采用各种给药途径给药，例如口服或者经由静脉内、皮下、肌肉内、腹腔内和鼻咽等给药。
另外，对于口服摄取困难的疾病患者等，也可以作为用于经肛门给药或经鼻饲管、肠道直接给药等的营养补充剂使用。
(5)在食品等中的使用如上所述除菌处理后的含抗体乳可以添加到食品等中，提高这些物质的附加价值。
食品可以采取固体、液体、溶胶、凝胶、粉末和颗粒等所有形态，可以采用本技术领域公知的任意制法制造。例如西式点心类、日式点心类、中式点心类、冰点心、冷食品、餐后甜点、酸乳酪、油脂类、乳制品奶油类、酱类(paste)、畜肉(或鱼肉)制品类、鱼肉膏制品、山珍海味类、填塞菜品、用调料煮的鱼贝类小菜、肉类加工品、面类、调料等。
可以添加的饮料主要是牛奶、果实饮料，以及液体酸乳酪、乳酸菌饮料(直接饮用)、酸乳饮料(稀释用)等乳性饮料，甜酒等米曲饮料，豆奶、咖啡、可可茶等种实类饮料，未发酵茶(绿茶)、半发酵茶(乌龙茶)、发酵茶(红茶)等芽叶类饮料，以及碳酸饮料等。
药品可以采用本技术领域公知的任意形态。例如除液体制剂以外，还可以制成片剂、胶囊(如果是显示肠溶性的材料，则更优选)粉末、溶胶、凝胶、颗粒和用脂质体包合等的剂型。
制成各种制剂时，能够以药学上允许的量使用本领域技术人员公知的各种赋形剂或添加剂等。根据其形态和制剂形态等，可以采用各种给药途径给药，例如口服或者经由静脉内、皮下、肌肉内、腹腔内和鼻咽等给药。
另外，对于口服摄取困难的疾病患者等，也可以作为用于经肛门给药或经鼻饲管、肠道直接给药等的营养补充剂使用。
保健品是指药事法第2条定义的口中清凉剂、腋臭防止剂、痱子粉类、生发剂(养发剂)、除毛剂、染发剂、浴用剂、药用化妆品和药用牙膏类等。
龋齿菌的抗体等可以用于牙膏、漱口水和口香糖等口腔用组合物。
而且，作为家畜、家禽和鱼等饲养动物的高活性免疫赋活剂，可以混合到饲料、饵料、药品等中。
另外，可以将龋齿菌的抗体添加到口腔用组合物中，且可以将抗毛发角蛋白抗体(H.UchiwaJ.Soc.Cosmet.Chem.，48，209(1997))、痤疮菌的抗体等添加到化妆品、药品相关的商品中。
本发明中使用的香料包括食品、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品等用的香料。香料能够以香精(水溶性香料)、油(油溶性香料)、乳化香料、粉末香料等各种形态使用。
含有采用本发明的过滤除菌方法得到的含抗体乳是指可以在例如饮食品等的制造结束前的工序中使饮食品等含有含抗体乳，作为其方法，可以适当选择例如50℃以下的低温下混合、分散等公知的方法。
另外，添加含抗体乳之后，应尽快冷却至室温以下。
本发明的免疫赋活剂能够以食品、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品等各种形态适用于各种感染症。作为可以适用的感染症，例如呼吸系统感染、口腔感染、消化系统感染、咽部感染等，也可以在其它感染症的情况下给药。
过滤除菌后的含抗体乳(液体)的摄取量为每天每1kg体重1～20g，优选5～10g的范围。例如，作为健康食品摄取时，优选将45g用50℃的水稀释到5倍(225g水溶液)，早晚2次，与普通牛奶同样饮用(450g乳溶液/60kg体重＝7g乳溶液/kg体重)。
图1是本发明使用的优选微孔滤器的部分截面侧视图。
图2是本发明优选的含抗体乳的过滤处理流程图。
图1和图2中的符号如下所述。
1、18微孔滤器2滤膜2a 滤膜第2层2b 滤膜第1层3支撑体4流路5浓缩液6含抗体乳11 原乳罐12、15、17 泵13、16 热交换机14 离心分离机发明的最佳实施方式其次，结合实施例和比较例更具体地说明本发明，但是这些实施例不能以任何含义限定本发明。
试验例1抗菌性的含抗体乳(1)多效抗原的制备培养细菌后(37℃、48小时)，在60℃下将培养基加热2小时，杀灭细菌。用蒸馏水洗涤灭菌培养基，离心分离，回收细胞。将杀灭的各细菌的细胞混合，制备多效抗原。
表1菌性抗原细菌美国模式培养物保藏号金黄色葡萄球菌 11631表皮葡萄球菌155化脓性链球菌 A1型 8671同上 A3型 10389同上 A5型 12347同上 A8型 12349同上 A12型11434同上 A14型12972同上 A18型12357同上 A22型10403产气菌 884大肠菌 26肠炎菌 13076绿脓杆菌7700肺炎杆菌9590鼠伤寒沙门氏菌 13311流感嗜血杆菌9333绿色链球菌 6249普通变形杆菌13315痢疾杆菌11835链球菌B群肺炎双球菌变异链球菌痤疮菌1型痤疮菌2型(2)抗菌性含抗体乳的生产采用下述方式将上述(1)制备的多效抗原(5ml的细菌，20×108个/ml)给予健康的牛，开始给予抗原后的第5周以后，由免疫后的牛挤乳。
〔抗原的给予方式〕i)给予方法肌肉注射ii)给予间隔给予开始后的第1周～第4周，1次/周给予开始后的第5周以后，2次/月(3)抗菌性含抗体乳的过滤除菌处理以下，基于图2进行说明。
将上述(2)得到的当日运送到牛乳工厂的抗菌性含抗体乳500升，用泵(12)由罐(11)输送到热交换器(13)中，加热至48℃。
接着，使用离心分离机(14)(テトラパツク公司制“29AE型”)，在48℃下，以离心力7400g(离心力Max.7440G)进行脱脂处理，除去脂肪成分。
接着，用泵(15)将脱脂处理后的含抗体乳20升输送到热交换器(16)中，加热至48℃后，用泵(17)输送到过滤装置(テトラパツク公司制精密过滤系统“Tetra alcrossM”)上安装的微孔滤器中。
微孔滤器是具有下述性能的法国Societe des CeramiquesTechniques公司制造的陶瓷滤器“Sterilox MF”。
过滤的处理温度为50℃，滤器透过流量为410升/h·m2，使含抗体乳沿着滤器表面高速移动。
使装置运转约13分钟，连续除去细菌含量多的浓缩液2升，得到透过液(过滤除菌后的抗菌性含抗体乳)18升。
实施例2抗病毒性的含抗体乳
(1)用于抗病毒性含抗体乳的抗原的制作与铃木等“感染症学杂志”(第73卷第2号，第122～129页(1999))记载的方法同样进行制作。也就是，使柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A9型(CVA9(Bozek株))感染LLC-MK2细胞，使用含2％胎牛血清(FBS)的最小必需培养基(MEM，GIBCO BRL公司产品)培养2天。
在通过10000g 30分钟的离心得到的培养上清液中加入30％聚乙二醇和0.4％NaCl，在4℃下静置16小时。
10000g离心30分钟后，将沉渣再次用STE液〔0.15M NaCl，0.15MTris-HCl，0.15M EDTA-2Na(pH7.4)〕悬浊。接着，将该悬浊液叠加到30％和60％(W/V)蔗糖不连续梯度中，以100000g在4℃下离心2.5小时。
回收60％蔗糖界面上的区域(band)，用β-丙内酯(和光纯药社制)进行失活处理，以其作为用于含抗体乳的病毒抗原。
(2)抗病毒性含抗体乳的生产将免疫病毒抗原(0.5mg/ml protein)10ml与弗罗因德氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，三光纯药社制)一起给母牛皮内接种。
免疫以2周为间隔进行，采用ELISA法确认血中的抗体上升后，使之妊娠。
分娩后，挤乳，得到脂肪含量为3.8％的抗病毒性含抗体乳。
(3)抗病毒性含抗体乳的过滤除菌处理与上述实施例1同样，对上述(2)得到的抗病毒性含抗体乳20升进行过滤除菌处理，得到透过液(抗病毒性过滤除菌的含抗体乳)18升。
比较例1抗菌性含抗体乳的加热灭菌处理分别采用低温灭菌法(63℃，30分钟)、高温短时间(HTST)灭菌法(77℃，15秒)和超高温加热(UHT)灭菌法(150℃，1秒)，对上述实施例1得到的过滤除菌前的抗菌性含抗体乳进行加热灭菌。
〔杂菌的残留试验〕实施例1得到的抗菌性含抗体乳中所含杂菌的残留测定用样品使用注射器利用密闭系统由微孔滤器的透过液和浓缩液的各隔膜采集(共计3次，3个样品)，在下述培养条件①～③下进行杂菌的残留试验。
另外，对于比较例1得到的加热灭菌处理后的含抗体乳以及完全没有进行除菌处理的含抗体乳也进行同样的试验。
培养开始2周后，将临床用巯基乙酸盐(TGC)培养基中可以见到混浊的样品判断为菌繁殖阳性。另外，将心脏浸剂(HI)琼脂培养基中可以见到菌落繁殖的样品判断为菌繁殖阳性。结果如表2所示。
〔培养条件〕①100ml玻璃瓶内培养试验(表2中，用“100ml TGC”表示)在装有临床用巯基乙酸盐(TGC)培养基100ml的150ml玻璃瓶中加入被测体10ml，这种样品准备2只。1只在30℃，另1只在37℃的温度下培养2周，观察液体培养基有无混浊。
②10ml试管内培养试验(表2中，用“10ml TGC”表示)在装有临床用巯基乙酸盐(TGC)培养基10ml的30ml试管中加入被测体1ml，这种样品准备2只。1只在30℃，另1只在37℃的温度下培养2周，观察液体培养基有无混浊。
③心脏浸剂琼脂培养基培养试验(表2中，用“HI琼脂培养基”表示)在心脏浸剂(HI)琼脂培养基中滴加被测体0.1ml，37℃下培养，每天观察有无菌落的繁殖。
〔免疫球蛋白(IgG)的残留试验〕实施例1的过滤除菌后的含抗体乳、比较例1的加热灭菌后的含抗体乳以及完全没有进行除菌处理的含抗体乳的IgG残留率分别如表2所示。另外，IgG含量通过免疫扩散法测定。
表2 菌残留以及IgG残留率37℃培养 30℃培养 37℃培养IgGNo. 被测体残留率100ml 10ml 100ml 10ml HI (％)TGC TGCTGC TGC琼脂培养基「滤过除菌」(实施例1)1.透过液①- - --- 1002.透过液②- - --- 1003.透过液③- - --- 100「加热灭菌」(比较例1)4.低温灭菌(63℃、30分) + + +++ 755.HTST灭菌(75℃、15秒) + + +++ 756.UHT灭菌(150℃、1秒) - - --- 07.未进行除菌处理 + + +++ 100的含抗体乳(注)+菌阳性、-菌阴性如表2所示，实施例1的用“Sterilox MF”(商品名)过滤后的过滤除菌含抗体乳(透过液①、②、③)无限接近于无菌，而且IgG100％残留。
确认未进行除菌处理的含抗体乳(被测体No.7)、加热灭菌处理中低温灭菌(63℃，30分钟；被测体No.4)以及HTST灭菌(77℃，15秒；被测体No.5)的含抗体乳均没有菌的繁殖。
另一方面，虽然确认UHT灭菌(150℃，1秒；被测体No.6)的含抗体乳中没有菌的繁殖，但是也不存在IgG。由这些结果可以得知，采用加热灭菌法难以制造无菌或近似无菌的“IgG没有热劣化的含抗体乳”。
由上述内容可以得知，将含抗体乳脱脂后，只有用”Sterilox MF”(商品名)过滤除菌，才能制造“无菌或近似无菌，且IgG抗体没有热劣化的含抗体乳”。
比较例2将微孔滤器由“Sterilox MF”(商品名)更换为“Membralox MF”(法国Societe des Ceramiques Techniques公司制造的陶瓷制滤器的商品名)，在与实施例1同样的条件下对脱脂后的含抗体乳进行除菌处理。其中，“Membralox MF”虽然是交叉流动方式的滤器，但是与“Sterilox MF”相比，滤膜的厚度仅有一半，而且所述滤膜为单层。透过流量为480升/h·m2(处理温度50℃)。除菌试验结果如表3所示。可以得知没有充分除菌。
表3 使用Membralox MF的抗细菌性含抗体乳的除菌试验结果滤过后的含抗体乳 37℃培养 30℃培养No.
试管序号 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5① + + + + + + + + + +② + + + + + + + + + +③ + + + + + + + + + +④ + + - + + + + + + +⑤ + + - - - + + + + +⑥ + + + + + + + + + +⑦ - + - + + + + + + +⑧ + + + + + + + + + +⑨ - + + + + - + - + -(注1)+表示用巯基乙酸盐培养基培养14天后，呈繁殖阳性。
-表示用巯基乙酸盐培养基培养14天后，呈繁殖阴性。(注2)试管序号①～⑨是过滤得到的透过液的级分序号。另外，横栏中1～5的数字表示将相同级分序号的样品分装在5个试管中，在37℃和30℃这2种条件下进行培养。
比较例3将微孔滤器由“Sterilox MF”(商品名)更换为下述醋酸纤维素滤器，在与实施例1同样的条件下对脱脂后的含抗体乳进行除菌处理。
Membrane Filter Cellulose Acetate(Toyo Roshi Kaisha，Ltd.)(直径90mm，平面状)(孔径0.45μm、0.8μm、1μm和5μm 4种)单独或组合使用上述醋酸纤维素滤器，对脱脂后的含抗体乳进行过滤。
结果如表4所示。使用孔径0.8μm以上的滤器，能够过滤，但是不能充分除菌。另外，孔径0.45μm以下，则堵塞，不能过滤。
表4 用醋酸纤维素滤器的除菌试验结果No. 滤器的孔径(μm)组合 能否滤过 除菌①5μm○ ×②5μm后、1μm○ ×③5μm后、1μm后、 0.8μm○ ×④5μm后、0.45μm × -⑤5μm后、1μm后、0.45μm × -⑥5μm后、1μm后、0.8μm后、0.45μm × -⑦0滤纸(1μm) × -(注)○能滤过、×不能滤过、-未测定实施例3含有过滤除菌后的抗病毒性含抗体乳的液状酸乳酪的制造在生乳和脱脂乳粉的混合乳原料中，接种使用嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)配制的引酵物5％，在40℃下培养直到pH达到4.2，得到液状酸乳酪。
在无菌填充室中，将该液状酸乳酪90重量份、以及实施例2得到的过滤除菌后的抗病毒性含抗体乳10重量份，填充到灭菌后的容器中，制造带有抗病毒抗体的液状酸乳酪。
按照下述方法，测定上述带有抗病毒抗体的液状酸乳酪的中和抗体效价。
比较例4含有低温灭菌后的抗病毒性含抗体乳的液状酸乳酪的制造在无菌填充室中，将与实施例3同样得到的液状酸乳酪原液90重量份、以及对实施例2得到的过滤除菌前的抗病毒性含抗体乳进行低温灭菌(63℃，30分钟)后的物质10重量份混合，填充到灭菌后的罐状容器中，制造带有抗病毒抗体的液状酸乳酪。
按照下述方法，测定上述带有抗病毒抗体的液状酸乳酪的中和抗体效价。
实施例4含有过滤除菌后的抗病毒性含抗体乳的运动饮料的制造按照本领域技术人员公知的方法，在无菌填充室中，将按照表5所示成分和配比制造的加热灭菌后的运动饮料98重量份、以及实施例2得到的过滤除菌后的抗病毒性含抗体乳2重量份，填充到灭菌后的罐状容器中，制造运动饮料。另外，表5中的数值单位均为重量份。
按照下述方法，测定上述带有抗病毒抗体的运动饮料的中和抗体效价。
其中，运动饮料(Sport drink)是指主要目的在于补充因运动等损失的体内的水分、电解质等的饮料。在1965年前后，美国为了缓解足球选手由于剧烈运动引起的脱水，开发了这种饮料。在运动饮料中，添加用于补充能量的糖类3～6％、其它无机盐类、香料等。为了使水分有效地吸收到体内，大多数运动饮料的渗透压与体液的渗透压几乎相等，因此也称为“等渗饮料”。
表5 运动饮料成分配比(重量％)浓缩橙汁0.200砂糖1.8异构化糖5.5枸橼酸 0.14盐 0.08枸橼酸钠0.07氯化钾 0.04磷酸二氢钙 0.013谷氨酸钠0.004氯化镁 0.003抗坏血酸0.1乳化香料0.11香精0.2过滤除菌后的抗病毒性含 2.0抗体乳(实施例2)水 余量合计100.0％〔中和抗体效价的测定方法〕将LLC-MK2细胞分别注入微孔板中，形成单层时进行中和反应。制作下述表6的饮食品样品①～④的2倍梯度稀释系列，等量加入100倍浓度的组织培养感染量(100×TCID50/ml)的稀释病毒，在37℃下使之反应。反应后，使细胞感染，在37℃下培养，以可见细胞变性的稀释倍数作为中和抗体效价。柯萨奇病毒A9型(CVA9)的中和抗体效价如表6所示。
过滤除菌后的抗病毒性含抗体乳对CVA9显示32000(215)倍以上的高抵抗力。
根据这些结果可以得知，通过过滤除菌，能够制造无菌或近似无菌的中和抗体效价高的含抗体乳，另外即使将其添加到食品、饮料中，中和抗体效价也不降低。
表6 柯萨奇病毒A9型(CVA9)的中和抗体效价各种饮食品样品 柯萨奇病毒A9①过滤除菌后的抗病毒性含抗体215乳(实施例2)②含有过滤除菌后的抗病毒性含212抗体乳的酸乳酪(实施例3)③含有过滤除菌后的抗病毒性含29抗体乳的运动饮料(实施例4)④含有低温灭菌后的抗病毒性含28抗体乳的酸乳酪(比较例4)工业实用性由于本发明能够产生下述有利效果，因此具有工业实用性。
(1)采用本发明的除菌方法，能够保持从牛科动物挤取的含抗体乳的抗体活性高，同时以完全或近似完全的水平除去乳中的杂菌。另外，即使高速进行过滤处理，也不会发生滤器的堵塞，能够高效地进行除菌处理。
(2)含有用本发明除菌方法处理后的含抗体乳的免疫赋活剂由于抗体效价高，而且没有混入杂菌，因此是效果和安全性优良的免疫赋活剂。
(3)含有用本发明的除菌方法处理后的含抗体乳的食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品等由于抗体效价高，而且没有混入杂菌，因此免疫赋活效果和安全性优良，能够方便地预防、治愈、治疗或缓解细菌、病毒等各种病原体或其代谢产物引起的感染或发病。
权利要求
1.含抗体乳的除菌方法，其特征在于，从用选自病原体或其代谢产物的1种或2种以上抗原致敏使体内产生抗体的牛科动物挤取的含抗体乳的除菌处理中，进行脱脂处理后，使用陶瓷微粒形成的、包括具有滤孔且厚度为40～150μm的滤膜以及支撑体的微孔滤器进行过滤。
2.如权利要求1所述的除菌方法，其中，陶瓷微粒的平均粒径为0.2～2.0μm，滤孔的平均孔径为0.4～2.0μm。
3.如权利要求1所述的除菌方法，其中，微孔滤器采用交叉流动方式。
4.如权利要求1所述的除菌方法，其中，微孔滤器是Sterilox MF(法国Societe des Ceramiques Techniques公司的商标)。
5.如权利要求1所述的除菌方法，其中，病原体是引发消化系统或呼吸系统疾病的细菌或病毒。
6.免疫赋活剂，其中，含有进行了权利要求1所述的除菌处理的含抗体乳作为有效成分。
7.食品、饮料、营养补充剂、饲料、饵料、药品、保健品和化妆品，其中，含有进行了权利要求1所述的除菌处理的含抗体乳。
全文摘要
本发明涉及含抗体乳的除菌方法，其特征在于，从用选自病原体或其代谢产物的1种或2种以上抗原致敏使体内产生抗体的牛科动物挤取的含抗体乳的除菌处理中，进行脱脂处理后，使用陶瓷微粒形成的、包括具有滤孔且厚度为40～150μm的滤膜以及支撑体的微孔滤器进行过滤。本发明提供过滤除菌的方法，该方法能够保持含抗体乳的抗体活性，同时有效过滤除去乳中的杂菌达到近似无菌状态的水平；并且提供以除菌后的含抗体乳作为有效成分的免疫赋活剂，以及添加了含抗体乳的食品、饮料等。
文档编号A23L1/305GK1482861SQ01821365
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月25日 优先权日2000年12月26日
发明者三原智, 庄田雅树, 桥爪秀一, 龟井优德, 铃木达夫, 一, 夫, 德, 树 申请人:小川香料株式会社, 森永制果株式会社