专利名称：合成单链核酸的方法
技术领域：
本发明涉及合成单链DNA的方法，更具体地讲，涉及选择性合成双链DNA中有义或反义链中的一条的方法。
背景技术：
制备用作杂交测定的探针的单链DNA的最常用方法，是用加热或碱使双链DNA变性。但是，用此方法，在产物中存在互补链，因此，互补链在形成双链的条件下会重新互相结合。这样有时降低了杂交效率。也已知通过使用单链噬菌体如M13进行克隆而制备单链DNA的方法，但是这个方法成本高且费时。
一个包含大约几十个碱基的小的单链DNA序列，可以用化学方法，毫无困难地合成。相反，如果要化学合成一个超过100个碱基的长单链DNA序列，其得率和碱基序列的精确率都会降低。虽然T7RNA多聚酶可以DNA为模板，合成单链RNA，但是模板DNA需要一个上述酶所识别的启动序列。
相比之下，WO 99/09211公开了一个扩增双链核酸的第一条链上的靶序列的方法。在该方法中，采用一种限制性酶切割双链核酸，以这种切割，切割第一条链上靶序列的5’端，以便在第二条链上形成一个突出的3’端区。随后，采用与第二条链3’端互补的引物和一种链置换型聚合酶，并采用所述第二条链作为模板，进行延伸反应，从而扩增所述靶序列。在此方法中，用引物合成靶序列的同时，原则上说，也会产生一个限制位点。然而，在反应起始时，靶区在5’端应有所述限制位点，但其识别位点并没有充分公开。而且，该方法是链置换扩增(SDA)方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，392-396；1992][NucleicAcid.Res.，20，1691-1696；1992]的改进形式，链置换扩增法原本是用来扩增双链DNA的。因此，在通过切割产生的每个3’一侧的突出部分的序列彼此相同(回文序列)，甚至只用一个引物就能合成有义链和反义链两条连。具体而言，该方法并不总是提供单链DNA。
简要描述SDA方法。SDA法是采用一种特殊DNA聚合酶的方法。当从一种与某一段碱基序列的3’一侧互补的引物开始互补链，并且所述碱基序列5’一侧存在双链区时，合成所述互补链，以置换所述双链区的一条链。在SDA法中，通过引物在退火的序列中预先插入限制性酶识别位点，可以省略掉PCR中所必须的变温步骤。具体地讲，用限制性酶产生的缺口，使3’-OH作为互补链合成的起始点，由此点进行链置换合成。因此，先前合成的互补链被游离为单链形式，并且再用作下个互补链合成的模板。以此方式，SDA法就不需要PCR中要求的复杂的温度控制。
发明的公开本发明的目的是提供一个选择性和高效地合成相对长的有义链或反义链的方法。
本发明人已经进行了大量的研究，其结果是发现了可以选择性和高效地合成单链核酸。这涉及到应用一种采用LAMP法扩增DNA的方法和一种限制性酶，所述限制性酶能够形成具有突出3’端的片段并进行切割，以便使所述片段单链区的碱基序列在切割后彼此不同。这使本发明得以完成。更具体地讲，本发明包括以下方面。
(1)一种合成单链核酸的方法，所述方法包括以下步骤1)用一种限制性酶，以这样的方式切割在比靶序列更靠近5’一侧的位置上具有一个限制性酶识别序列的双链DNA，使得a)形成具有突出3’端的片段，且b)在切割后，所述片段单链区的碱基序列彼此不同；2)让至少3’端具有与所述DNA片段中经所述限制性酶切割出的单链区互补的碱基序列的引物，退火到所述单链区上；3)用一种链置换型聚合酶从所述引物的3’端开始，合成单链核酸。
(2)依照上面(1)所述的方法，其中按包括下列步骤的方法提供具有所述限制性酶识别序列的双链DNA1)采用一种在克隆位点或邻近克隆位点具有所述限制性酶识别序列的载体，克隆待扩增的DNA；2)采用一种使用退火到所述限制性酶识别序列或其3’一侧的引物的DNA扩增方法，扩增含有所述限制性酶识别序列和待扩增DNA的区域。
(3)按照上述(2)的方法，其中所述DNA扩增方法是LAMP法。
(4)按照上述(1)的方法，其中具有所述限制性酶识别序列的双链DNA是通过用包含所述限制性酶识别序列的引物，经过DNA扩增而提供的。
(5)按照上述(4)的方法，其中DNA扩增方法是采用以下A)和B)中所述引物的LAMP法当按从双链DNA的第一条DNA链上靶序列的3’端到所述DNA链的3’端的顺序选择第一任意序列F1c和第二任意序列F2c，并且按从所述靶序列的5’端到所述DNA链的5’端的顺序选择第三任意序列R1和第四任意序列R2时，则为A)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2和与F1c相同的序列的引物，或者一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2、所述限制性酶识别位点、和与F1c相同的序列的引物；和B)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与R2相同的序列、所述限制性酶识别序列、和与R1互补的序列R1c的引物。
(6)按照上述(5)的方法，其中所述合成DNA的步骤包括采用一种退火至比内部引物更接近3’一侧的部分上的外部引物。
(7)按照上述(1)到(6)所述任一方法，其中在切割位点上由所述限制性酶所产生的单链区至少包含5个碱基。
(8)按照上述(1)到(6)所述任一方法，其中在切割位点上由所述限制性酶所产生的单链区至少包含7个碱基。
(9)按照上述(1)到(8)所述任一方法，其中所述引物与可检测性标记物或固相结合，或经修饰而能够与之结合。
(10)一种内部引物对，所述引物对包含以下A)和B)当按从双链DNA的第一条DNA链上靶序列的3’端到所述DNA链的3’端的顺序选择第一任意序列F1c和第二任意序列F2c，并且按从所述靶序列的5’端到所述DNA链的5’端的顺序选择第三任意序列R1和第四任意序列R2时，则为A)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2和与F1c相同的序列的引物，或者一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2、下述限制性酶的识别位点、和与F1c相同的序列的引物，其中所述限制性酶a)能形成具有突出3’末端的片段，且b)能进行切割，以便使得切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不同；和B)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与R2相同的序列、所述限制性酶识别序列、和与R1互补的序列R1c的引物。
(11)一种用于合成单链核酸的载体，所述载体在克隆位点中或邻近克隆位点包含下述碱基序列，其中所述碱基序列被限制性酶以这样一种方式切割，使得a)形成带突出3’末端的片段，且b)切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不相同。
(12)一种用于合成单链核酸链的试剂盒，所述试剂盒至少包括以下试剂1)一种限制性酶，所述限制性酶
a)能形成具有突出3’末端的片段，且b)能够进行切割，以便使得片段的碱基序列彼此不同；2)一种能够退火至经所限制性酶切割上的所述DNA片段单链区上的引物；3)一种链置换型聚合酶；和4)按以上(10)所述的内部引物，或按以上(11)所述的用于合成单链核酸的载体。
在按照本发明的单链核酸的合成方法中，术语“单链核酸”是指由双链DNA的有义链或反义链中任一条链组成的DNA，即单链DNA。术语“退火”是指按Watson-Crick法则进行碱基配对而形成双链结构的核酸。因此，如果一条单链核酸在分子中形成这样的碱基配对，就是“退火”。在本发明中，“退火”和“杂交”是同义词，因为核酸分子具有经碱基配对而形成的双链结构。
在本发明中，术语“靶序列(或区)”是指应该以单链核酸形式合成的一段碱基序列(或区)。在模板双链DNA中，包含所述靶序列的链指的是第一条链，而所述互补链指的是第二条链。
在本发明中采用根据LAMP法的技术。所述LAMP法是一种扩增核酸的方法，该法由本发明人开发。在该法中，采用一种内部引物对或者通过加入一种外部引物对至内部引物对而制备的两个或四个特异性引物对、一种链置换型DNA聚合酶和一种核苷酸底物，在等温条件(约65℃)下，快速而成本有效地扩增DNA或RNA。LAMP法的详细描述见Nagamine等，Clinical Chemistry(2001)，Vol.47，No.9，1742-1743，Notomi等，Nucleic Acids Research(2000)，Vol.28，e63，和国际申请(如WO 00/28082、WO 01/34838和WO 01/34790)。这些描述通过引用结合到本文中。
本发明采用一种限制性酶，所述酶能够a)形成具有突出3’末端的片段，和b)切割而使得在所述切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不同。切割后，大多数限制性酶形成具有突出5’末端的片段或具有平端的片段。然而，已知有少数限制性酶会在切割后形成含有突出3’末端的片段。引物退火到用所述酶切割后所述DNA片段的单链区上，并且可以用聚合酶合成核酸。为了通过让用引物退火至所述突出3’末端区而进行核酸合成反应，当考虑到碱基序列特异性和结合强度时，所述单链区应该包含至少5个碱基，最好是至少7个碱基。
某些限制性酶在夹在识别位点或与识别位点邻近点之间的任意序列中有切割位点。例如，BglI在序列GCCNNNNNGGC中的第七到第八碱基间切割。经这样的限制性酶切割的所述片段，产生在所述切割位点中有不同碱基序列的不对称片段。具体地讲，当用BglI切割序列GCCAAAAAGGC时，所述切割位点的碱基序列是GCCAAAA和GCCTTTT。在这样的不对称片段中，具有与其中之一互补的碱基序列的引物(探针)就不能与另一序列结合。
具有上述两个特点的限制性酶(下文称为本发明的限制性酶)的一个实例是TspRI。TspRI识别碱基序列NNCA(C或G)TGNN，并且在3’末端的任一碱基和邻近它的碱基之间进行切割。因此，切割后所述单链区包括9个碱基。
用TspRI作为实例描述了按照本发明的合成单链核酸的方法原理。如上所述，TspRI是一种限制性酶，它在切割表面的3’侧产生9个碱基的突出末端。进一步讲，在识别序列NNCA(C/G)TGNN两端的2个碱基(NN)可以是A、T、G或C的任意一种，并且能形成一个不对称识别序列。采用它能够合成链特异性DNA。例如，制备在BamHI克隆位点的两端具有TspRI位点的序列。用TspRI消化，可以产生具有不同碱基序列的四种3’突出末端。随后，从识别这四种末端(
图1[1])之一的序列，制备一种引物(GACACTGGA)。这个引物不是与[2]、[3]和[4]完全匹配的序列，所以不能退火。因此，当该引物退火至[1]并且引起延伸反应时，只使用同一条链作为模板进行合成反应。
上面提到的LAMP法的技术(Nucleic Acids Research(2000)，Vol.28，e63)可用于上述合成反应。例如，1)用具有所述限制性酶识别序列的载体，在克隆位点或邻近克隆位点克隆待扩增的DNA；2)随后，设计一种退火至所述限制性酶识别序列或其3’一侧的LAMP引物。
3)采用所述引物和链置换型聚合酶，用LAMP方法，扩增包含所述限制性酶识别序列和待扩增的DNA的区域。
从具有扩增的限制性酶识别序列的双链DNA合成单链DNA的方法如上所述。由于所述LAMP法可以在等温条件下，在短时间内提供大量DNA，故此可以结合LAMP法和上述合成方法，有效合成更具链特异性的单链DNA。
LAMP引物是指在所述LAMP法中采用的特异性引物，可以采用例如前面所提到的Nagamine等，“Clinical Chemistry(2001)”的方法容易地制备。
用于合成所述单链DNA的引物并无特别的限定，只要它与经所述限制性酶切割后的第二条DNA链上存在的3’末端的突出单链部分互补结合。所述长度不必与所述单链区的长度完全一致。它可能比所述5’一侧或3’一侧的单链区更短，或者比5’一侧的所述单链区更长，只要互补结合的特异性不受损害。
一种引物可以与一种可检测标记物或固相结合，或经修饰后能与之结合。当标记用于合成单链DNA的引物时，可采用已知的底物和标记方法。标记物的实例包括放射性物质、荧光物质、生物素和酶。这些标记物可以按照已知的方法加入到引物上，或者可以在化学合成引物时加入预先标记的核苷酸，以制备标记引物。可以将一种合适的官能团引入到引物上，以便使其能结合到上面提到的标记性物质或乳胶颗粒、磁微粒、或反应容器内壁上。
必须以这样的方式选择引物的标记位点，使之能退火到互补链上，或不会抑制后续的延伸反应。因此，例如，并不优选在3’端标记。按照其分子量的不同，标记物质可以通过作为接头的碱基序列而连接到5’一侧，以此防止发生位阻。
在本发明的合成单链核酸的方法中，可以用常规基因扩增方法，例如PCR和LCR，在不含本发明的限制性酶识别序列的双链DNA中插入所述识别序列。例如，将本发明所述限制性酶识别序列，掺入到所用的引物上，并且扩增靶序列或与其互补的序列。因此，可以将感兴趣的限制性酶识别序列插入到靶序列的3’一侧。
如上所述，可以采用一种包含加入到克隆载体的克隆位点中或邻近所述克隆位点之处的本发明所述限制性酶识别序列的载体。
按照本发明的优选实施方案，可以将所述限制性酶识别序列，通过LAMP法引入到不含本发明的限制性酶识别序列的双链DNA中。具体地讲，用包含插入的限制性酶识别序列的引物和LAMP扩增方法，可以快速制备大量的用于合成具有限制性酶识别序列的单链核酸的模板DNA链。
所述限制性酶识别序列应插入到第一条链的靶序列的5’一侧。尤其是，更优选所述序列插入到3’和5’两侧。更具体地讲，所述限制性酶识别序列对于退火至第二条链的3’突出部分的引物总是必要的，更优选的是，两种引物都包含所述序列。这是因为，限制性位点在两侧都存在，使得一种类型的酶可以在靶区的两侧切割。需要注意的是，用所述限制性酶切割得自每种引物的延伸产物所得的片段单链区的碱基序列最好是彼此不同的。
在本发明中，上述两种类型的引物被称为“内部引物”。
更具体地说，用所述LAMP法向双链DNA引入限制性酶识别序列的方法包括以下步骤1)按从双链DNA的第一条DNA链上靶序列的3’端到所述DNA链的3’端的顺序选择第一任意序列F1c和第二任意序列F2c，并且按从所述靶序列的5’端到所述DNA链的5’端的顺序选择第三任意序列R1和第四任意序列R2；
2)制备以下内部引物a)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2和与F1c相同的序列的引物，或者一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2、所述限制性酶识别位点、和与F1c相同的序列的引物；和b)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与R2相同的序列、所述限制性酶识别序列、和与R1互补的序列R1c的引物；3)用双链DNA的每一条作为模板、用所述引物和链置换型聚合酶合成DNA。
在前面提到的内部引物中，F2可以与所述限制性酶识别序列重叠，所述限制性酶识别序列可以与F1c重叠，或者它们之间可以插入几个碱基序列。同样，R2可以与所述限制性酶识别序列重叠，所述限制性酶识别序列可以与R1c重叠，或者它们之间可以插入几个碱基序列。F2/R2与所述限制性酶识别序列间的距离、或所述限制性酶识别序列和F1c/R1c间的距离优选为1到20个碱基，更优选1到10个碱基。
通过用诸如加热或碱的常规方法，使部分或全部双链DNA解离，可以首先将内部引物退火到双链DNA上。随后，在链置换型DNA聚合酶和核苷酸底物的存在下，在约55-70℃的等温条件下，重复进行DNA合成。
在前面提到的LAMP法中，也可以采用两类不同于内部引物的引物。这些引物退火到模板DNA的外侧，即比内部引物)更接近3’一侧，在本发明中，它们被称为“外部引物”。外部引物可以用以下方式来制备。
在第一条DNA链中，选择位于比F2c更靠近3’一侧的任意序列F3c，和一条比R2更靠近5’一侧的任意序列R3，并且分别制备a)一种包含与F3c互补的序列F3的引物，和b)一种包含与R3相同序列的引物，以作为外部引物。
从外部引物合成DNA，应在从内部引物合成DNA之后再开始合成。用于实现这一点的方法的实例包括其中设定内部引物的浓度比外部引物的浓度高(例如2-50倍，最好是4-25倍)的方法(a)；和其中设定内部引物的熔点(Tm)要比外部引物的要高的方法(b)。此外，进行LAMP法的条件可以适当参考上面提到的参考文献和专利来确定。
采用能够特异性地退火至扩增产物中具有由扩增形成的发夹结构的环部分的引物，可以更有效地进行LAMP方法。在本发明中，所述环特异性引物被称为“环引物”。如果将本发明所述限制性酶识别序列插入到所述环引物的3’端之一中，则所述环引物本身可作为合成单链核酸的引物。
本发明也提供了一种用于实施按照本发明的方法合成单链核酸的试剂盒。所述试剂盒可以例如用作用于合成供特定序列杂交测定用的单链核酸的试剂盒。
前面提到的试剂盒至少包括按照本发明所述限制性酶、一种能退火至经所述限制性酶切割的所述DNA片段单链区的引物、一种链置换型聚合酶和按照本发明所述的内部引物。所述试剂盒还可以包括按照本发明的外部引物和/或环引物。
除了上述试剂外，所述试剂盒还可以包括实施本发明的合成方法所必需的其他试剂，例如核苷酸底物、缓冲液或熔点调节物。
附图简述图1显示用TspRI合成单链核酸的原理。
图2为一幅照片，显示实施例1中延伸产物的杂交测定结果(A有义寡聚物，B反义寡聚物)。
图3为一幅照片，显示实施例2中LAMP反应产物和用TspRI处理的LAMP反应产物的电泳结果(M分子量标记，1LAMP产物，2经TspRI处理的LAMP产物)。
图4为一幅照片，显示实施例2的引物延伸产物(DIG标记的)的检测结果(1阴性对照，2引物延伸产物)。
图5为一幅照片，显示实施例2的引物延伸产物的斑点印迹杂交结果。
图6为一幅照片，显示实施例3中检测引物延伸产物(DIG标记的)的结果(1Klenow(-)，2Klenow(+)，3Bst(-)60℃，4Bst(+)60℃，5Bst(-)65℃，6Bst(+)65℃)。
图7为一幅照片，显示实施例4中经λ外切核酸酶处理的引物延伸产物的电泳结果(M分子量标记，1λ(-)，2λ(+))。
图8为一幅照片，显示实施例5中引物延伸产物(DIG标记的)的检测结果。
图9为一幅照片，显示实施例5中引物延伸产物的斑点杂交结果。
图10为一幅照片，显示实施例6中LAMP反应产物和经TspRI处理的LAMP反应产物的电泳结果(M分子量标记，1LAMP产物，2经TspRI处理的LAMP产物)。
图11为一幅照片，显示实施例6的引物延伸产物的斑点杂交结果。
本说明书包括在日本专利申请第2000-328219号说明书中公开的部分内容或所有内容，所述专利申请为本申请的优先权文件。
本发明的优选实施方案实施例11.载体的制备采用以下引物并且用pBluescript II载体(Genbank DB No.X52324)作为模板，进行PCR。T7TspRI(正向)5′-GACAGTGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(SEQ ID NO1)T3TspRI(反向)5′-GGATCCAGTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAAT-3′(SEQ ID NO2)向40μl的反应系统中，加入1×缓冲液(16mM(NH4)2SO4、50mMTris-HCl pH9.2、1.75mM MgCl2、0.001％(w/v)明胶)、0.2mM dNTPs、1.4U Taq DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶(EXpand Long Template PCRSystem，Roche)和0.5mM上述的特异性引物对。PCR在94℃20秒、62℃30秒、68℃120秒的条件下重复15次。
用T4 DNA聚合酶将扩增产物制成平端，用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物引入大肠杆菌DH5α中，从所得的转化子中获取目的载体(指定为“pBSTspRI”)。
从以上获得的载体中，缺失了pBluescriptII载体中从SacI到KpnI(下划线部分)的多克隆位点。取而代之的是，所述载体具有TspRI-BamHI-TspRI位点，可以在BamHI位点插入外源基因。
(A)pBluescriptII载体5′-GAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCG-3′(SEQ ID NO10)下划线的序列(SEQ ID NO11)指示多克隆位点。
(B)具有TspRI-BamHI-TspRI位点的序列5′-GGGACACTGGATCCGACAGTGTCGCCC-3′(SEQ ID NO3)2.DNA的克隆用Sau3AI消化pUC19载体(Benbank DB No.L09137)，分离109bp和82bp DNA片段。将这些片段插入到载体的BamHI位点并克隆。109 bp Sau3AI片段5’-GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATC-3′(SEQ IDNO12)82bp Sau3AI片段5′-GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATC-3′(SEQ ID NO13)3.LAMP反应通过LAMP反应(参见Nucleic Acids Research(2000)，Vol.28，e63)，用包含加入的Sau3AI片段的载体作为模板，扩增靶区。反应液的组成见表1，序列和引物浓度如下(表1)反应液的组成(在25μl中)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO48mM MgSO40.8M甜菜碱0.1％Triton X-1005.6mM dNTPs8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)引物内部引物(1600nM)正向5′-TCCAGTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCA-3′(SEQID NO4)反向5′-GACAGTGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3′(SEQ ID NO5)外部引物(400nM)正向5′-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3′(SEQ ID NO6)反向5′-GAATTGTGAGCGGATAACAAT-3′(SEQ ID NO7)环引物(800nM)正向5′-GCGCGCTTGGCGTAATCA-3′(SEQ ID NO8)反向5′-GCGCGCTCACTGGCCG-3′(SEQ ID NO9)制备未经热变性的靶DNA，让反应液在65℃反应。用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)将产物洗脱到200μl的Tris-HCl(pH8.0)中。
3.用TspRI消化让所述LAMP产物(25μl)在50U的TspRI(NEW ENGLANDBioLabs)中在65℃反应90分钟。反应后，产物用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)洗脱到100μl Tris-HCl(pH8.0)中。
4.引物延伸反应将一种用5’-地高辛(DIG)标记的引物(BSTspRI5’-GACACTGGA-3’)加入到TspRI片段中，用DNA聚合酶3’→5’外切-Klenow片段(NEW ENGLAND BioLabs)进行延伸反应。所用反应液的组成如表2所示。(表2)反应液组成10mM Tris-HCl(pH7.5)5mM MgCl27.5mM二硫苏糖醇0.25mM dNTPs5μM引物(BSTspRI引物)1U3’→5’外切Klenow片段(NEW ENGLAND BioLabs)在这种情况下，引物BSTspRI仅可以退火至经TspRI消化片段的一个粘性末端，因此，通过延伸反应应该获得一种单链DNA。
5.斑点杂交根据109bp Sau3AI DNA片段的碱基序列设计的一种有义寡聚物(109A oligo)或反义寡聚物(109B oligo)，转印到尼龙滤膜(BiodyneB，Pall)上。序列如下所示。109A oligo5′-GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC-3′(SEQ ID NO15)109B oligo5′-GCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGAC-3′(SEQ ID NO16)用所述延伸产物作为探针，对所述滤膜进行杂交。用PerfectHyb缓冲液(TOYOBO)在60℃下过夜进行杂交。用DIG核酸检测试剂盒(Roche)检测信号。结果是，在有反义寡聚物斑点的地方才能检测到信号(图2)。这表明已经获得了一种链特异性的单链DNA。
用在实例1中制备的所述82bp克隆载体用作模板，在与上述同样条件下进行LAMP反应。在此LAMP反应中，使用以下内部引物和与实例1中所用引物相同的外部引物(与实施例1浓度相同)来替代环引物。内部引物(1600nM)正向5′-GTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCACACAGGAAACAGCTATG-3′(SEQ ID NO17)反向5′-TGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCAGTCACGACGTTGTAAA-3′(SEQ ID NO18)用TspRI处理LAMP反应产物并用2％琼脂糖凝胶电泳证实LAMP反应产物(图3)。
用电泳证实用TspRI完全消化后，用与实施例1相同的方式进行引物延伸。为了证实实现了引物延伸，将产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳，并转移到尼龙膜(BiodyneB，Pall)上。用DIG核酸检测试剂盒(Roche)检测所述膜上的电泳产物中是否含有所述标记物(图4)。结果是，证实了TspRI产物中包含来自DIG标记引物的延伸产物。
既然证实所述产物已被标记，则用所述产物作为探针进行斑点杂交(图5)。已吸印的DNA如下182bp反义寡聚DNA(SEQ ID NO14)282bp有义寡聚DNA(SEQ ID NO13)3109A oligo4109B oligo582bp LAMP产物的热变性产物6无关LAMP产物(λDNA扩增产物)的热变性产物结果是，只在1和5中发现信号。这表明，甚至用不同模板，也只有链特异性DNA才能象实施例1中的那样被合成。由于在所述LAMP产物的热变性产物中也有信号，因此发现所述LAMP产物本身能作为探针的靶。因为其结构，也就是说，所述重复序列的存在，所述LAMP产物的杂交效率被认为是非常低。在所述研究中，由于用所述LAMP产物进行杂交，则提示有可能通过点样到DNA芯片的基片上而应用所述LAMP产物。
在此研究中，使用了5’端用DIG标记的引物。如果使用一种氨基接头或一种生物素标记引物，则所述标记的DNA链可以被分离出来。
实施例3用Bst DNA聚合酶的延伸反应使用Bst DNA聚合酶即一种链置换型DNA合成酶，来测定引物延伸是否可以进行。所用的反应液的组成如表3所示。(表3)反应液组成20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO40.1％ TritonX-1001.6mM dNTPs1U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)在60℃或65℃1小时后，将所述产物经2％琼脂糖凝胶电泳，再转移至尼龙膜(BiodyneB，Pall)，以证实实现了引物延伸。用DIG核酸检测试剂盒(Roche)来检测所述膜的电泳产物中是否含有所述标记物(图6)。结果证实了用Bst DNA聚合酶、从DIG标记的引物发生了延伸反应。
实施例4λ外切核酸酶处理引物延伸产物引物延伸后，产生了游离的单链DNA和双链DNA。从双链DNA的引物延伸的链在其5’端没有磷酸基团。因此，如果用λ外切核酸酶处理所述链，则DNA从模板DNA链的5’一侧开始分解，虽然已延伸的链没有被分解。这导致所述DNA链只在一侧存在。
用λ外切核酸酶处理(在37℃反应1小时)前述引物延伸产物(109bp引物延伸产物)。所用反应液的组成见表4。(表4)反应液组成67mM甘氨酸-KOH(pH9.3)2.5mM MgCl20.5Uλ外切核酸酶(USB)在37℃反应1小时后，用4％琼脂糖凝胶进行电泳。用λ外切核酸酶处理引物延伸产物并电泳，结果观察到一个迁移到约50bp的位置的条带(图7中第2泳道)。已知单链DNA的迁移率已经增加，由此认为这正是感兴趣的产物。因此证实了大量的单链DNA可以通过用λ外切核酸酶处理所述引物延伸产物而获得。
实施例5用TspRI缓冲液的Bst DNA聚合酶延伸反应1.用TspRI缓冲液进行Bst DNA聚合酶反应。
用作模板的所述LAMP产物与实施例2中的所述产物一样。在此例中，采用终浓度为0、0.25、0.5、1.0和2.0mM的dNTPs。所用反应液的组成见表5。(表5)反应液组成20mM Tris-醋酸pH7.950mM醋酸钾10mM醋酸镁1mM DTT0.25-2mM dNTPs0.1U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)5μM引物在37℃反应1小时后，反应产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳，转移至尼龙膜(BiodyneB，Pall)，以证实实现了引物延伸。用DIG核酸检测试剂盒(Roche)来检测所述膜上的电泳产物中是否含有所述标记物(图6)。结果证实了用Bst DNA聚合酶和TspRI缓冲液，从引物发生了延伸反应。
这表明采用所述法由于共用一种缓冲液可以减少必需的费用。2.既然已证实用TspRI缓冲液发生了延伸，随后也检测了LAMP之后的反应是否可以同时进行。所用反应液的组成见表6。(表6)反应液组成20mM Tris-醋酸pH7.950mM醋酸钾10mM醋酸镁1mM DTT1mg/ml BSA0.5mM dNTPs7.5U TspRI(NEW ENGLAND BioLabs)5μM引物在LAMP反应后，向反应系统加入所述反应液(1/50的量)，让其在37℃反应1小时。反应液中BstDAN聚合酶的量是0.16U。在实施例中已证实0.1U的酶足以进行所述反应。反应后，用所述产物作为探针进行斑点杂交(图9)。吸印的DNA如下。
182bp的反义寡聚DNA282bp的有义寡聚DNA3109A oligo4109B oligo
结果是，在82bp反义寡聚物印迹的位置(1)观察到一个强信号。在有义寡聚物一侧(2)观察到一个微弱信号，被认为是在用TspRI的反应中仍未切割的部分所产生的。因此，证实了特异性扩增产物的产生。
这些结果表明，使用所述方法，可以降低成本和减少必需的时间。实施例6用LAMP引物插入限制性酶识别序列1.为了从不具有TspRI位点的模板获得链特异性单链，用以下插入了TspRI识别序列的内部引物等、和作为模板的5ng的pUC 19质粒(SEQID NO19)等进行LAMP反应。内部引物(1600nM下划线部分指示TspRI识别序列插入部分)正向5′-GACCAAGTTTACTCATATATACGACACTGGAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAG-3′(SEQ ID NO20)反向5′-TGAGGCACCTATCTCAGCGATGACAGTGTCACGGGGAGTCAGGCAACTAT-3′(SEQID NO21)外部引物(400Nm)正向5′-TCAAAAAGGATCTTCACCTA-3′(SEQ ID NO22)反向5′-GTATCGTAGTTATCTACACG-3′(SEQ ID NO23)环引物(800nM)正向5′-ACTTTAGATTGATTTAAAA-3′(sEQ ID NO24)反向5′-TCTGTCTATTTCGTTCATCC-3′(SEQ ID NO25)反应液的组成与实施例1中的相同，LAMP反应在62.8℃进行2小时。此后，所述LAMP扩增产物以与实施例1中的方式用TspRI消化。所述LAMP产物和TspRI消化物在2％琼脂糖凝胶中电泳。结果证实所述产物具有目标分子量的大小(图10)。2.随后，通过引物延伸进行DIG标记并进行斑点杂交。吸印的DNA如下。
1109A oligo2109B oligo结果证实，信号只可以在感兴趣的斑点中产生(图11)。
这表明可以用LAMP法将所述限制性酶识别序列插入到不包含TspRI位点的模板中，并且用此作为模板，可以获得链特异性链。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用结合到本文中。
工业应用性按照本发明，双链核酸的有义链或反义链的任一条可以被选择性地合成。这种单链DNA可以用作例如杂交测定的探针等。本发明提供了一种有效和节约成本的合成单链DNA的方法。序列表的独立文本SEQ ID NO1T7TspRI引物(正向)SEQ ID NO2T7TspRI引物(反向)SEQ ID NO3TspRI-BamHI-TspRI位点SEQ ID NO4内部引物(正向)SEQ ID NO5内部引物(反向)SEQ ID NO6外部引物(正向)SEQ ID NO7外部引物(反向)SEQ ID NO8环引物(正向)SEQ ID NO9环引物(反向)SEQ ID NO10pBluescriptIISEQ ID NO11源于pBluescriptII的多克隆位点
SEQ ID NO12pUC19 109bp Sau3AI片段(有义)SEQ ID NO13pUC19 82bp Sau3AI片段(有义)SEQ ID NO14pUC19 82bp Sau3AI片段(反义)SEQ ID NO15109A oligo基于pUC19 109 bp Sau3AI片段设计的寡核苷酸(有义)SEQ ID NO16109B oligo基于pUC19 109bp Sau3AI片段设计的寡核苷酸(反义)SEQ ID NO17内部引物(正向)SEQ ID NO18内部引物(反向)SEQ ID NO19pUC19SEQ ID NO20内部引物(正向)SEQ ID NO21内部引物(反向)SEQ ID NO22外部引物(正向)SEQ ID NO23外部引物(反向)SEQ ID NO24环引物(正向)SEQ ID NO25环引物(反向)
序列表<110> 荣研化学株式会社(Eiken Chemical Co.，Ltd.)<120> 合成单链核酸的方法<130> WP-038<150> JP2000-328219<151> 2000-10-27<160> 25<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述T7TspRI引物(正向)<400> 1gacagtgtcg ccctatagtg agtcgtatta 30<210> 2<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述T7TspRI引物(反向)<400> 2ggatccagtg tccctttagt gagggttaat 30<210> 3<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述TspRI-BamHI-TspRI位点<400> 3gggacactgg atccgacagt gtcgccc27<210> 4<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(正向)<400> 4tccagtgtcc ctttagtgag ggttaatttc acacaggaaa cagctatgac ca52<210> 5<211> 53<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(反向)<400> 5gacagtgtcg ccctatagtg agtcgtatta ccagtcacga cgttgtaaaa cga 53<210> 6<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述外部引物(正向)<400> 6gtaacgccag ggttttcc 18<210> 7<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述外部引物(反向)<400> 7gaattgtgag cggataacaa t 21<210> 8<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述环引物(正向)<400> 8gcgcgcttgg cgtaatca18<210> 9<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述环引物(反向)<400> 9gcgcgctcac tggccg 16<210> 10<211> 440<212> DNA<213> 未知<220><223> pBluescriptII<400> 10gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 60atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 120agctatgacc atgattacgc caagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg 180gagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga actagtggat cccccgggct gcaggaattc 240gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccca attcgcccta 300tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 360ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 420tagcgaagag gcccgcaccg 440<210> 11<211> 108<212> DNA<213> 未知<220><223> 得自pBluescriptII的多克隆位点<400> 11gagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga actagtggat cccccgggct gcaggaattc 60gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtacc 108<210> 12<211> 109<212> DNA<213> 未知<220><223> pUC19 109bp Sau3AI flagment(有义)<400> 12gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 60gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatc 109<210> 13<211> 82<212> DNA<213> 未知<220><223> pUC19 82bp Sau3AI flagment(有义)<400> 13gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 60catgagatta tcaaaaagga tc 82<210> 14<211> 82<212> DNA<213> 未知<220><223> pUC19 82bp Sau3AI flagment(反义)<400> 14gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 60gtcagacccc gtagaaaaga tc 82<210> 15<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述109 oligo基于pUC19 109bp Sau3AI flagment设计的寡核苷酸(有义)<400> 15gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagc 45<210> 16<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述109 oligo基于pUC19 109bp Sau3AI flagment设计的寡核苷酸((反义)<400> 16gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagac 45<210> 17<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(正向)<400> 17gtgtcccttt agtgagggtt aatttcacac aggaaacagc tatg 44<210> 18<211> 44<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(反向)<400> 18tgtcgcccta tagtgagtcg tattaccagt cacgacgttg taaa 44<210> 19<211> 187<212> DNA<213> 未知<220><223> pUC19<400> 19tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 60agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 120tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 180acgatac 187<210> 20<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(正向)<400> 20gaccaagttt actcatatat acgacactgg agatcctttt aaattaaaaa tgaag 55<210> 21<211> 50<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述内部引物(反向)<400> 21tgaggcacct atctcagcga tgacagtgtc acggggagtc aggcaactat50<210> 22<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述外部引物(正向)<400> 22tcaaaaagga tcttcaccta 20<210> 23<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述外部引物(反向)<400> 23gtatcgtagt tatctacacg 20<210> 24<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述环引物(正向)<400> 24actttagatt gatttaaaa 19<210> 25<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述环引物(反向)<400> 25tctgtctatt tcgttcatcc 20
权利要求
1.一种合成单链核酸的方法，所述方法包括以下步骤1)用一种限制性酶，以这样的方式切割在比靶序列更靠近5’一侧的位置上具有一个限制性酶识别序列的双链DNA，使得a)形成具有突出3’末端的片段，且b)在所述切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不同；2)让至少在3’端具有与所述DNA片段中经所述限制性酶切割出的单链区互补的碱基序列的引物，退火到所述单链区上；且3)用一种链置换型聚合酶从所述引物的3’末端开始，合成单链核酸。
2.权利要求1所述的方法，其中具有所述限制性酶识别序列的所述双链DNA是通过包括以下步骤的一种方法提供的1)采用在克隆位点或邻近所述克隆位点具有所述限制性酶识别序列的一种载体，来克隆待扩增DNA；2)采用退火至所述限制性酶识别序列或其3’一侧的一种引物，通过DNA扩增方法，扩增包含所述限制性酶识别序列和待扩增DNA的区域。
3.权利要求2所述的方法，其中所述DAN扩增法是LAMP法。
4.权利要求1所述的方法，其中所述具有所述限制性酶识别序列的双链DNA，是采用一种包含所述限制性酶识别序列的引物通过DNA扩增法而提供的。
5.权利要求4所述的方法，其中所述DNA扩增方法是采用以下A)和B)描述的引物进行的LAMP法当按从所述双链DNA的第一条DNA链上所述靶序列的3’端到所述DNA链的3’端的顺序选择第一任意序列F1c和第二任意序列F2c，并且按从所述靶序列的5’端到所述DNA链的5’端的顺序选择第三任意序列R1和第四任意序列R2时，则为A)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2和与F1c相同的序列的引物，或者一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2、所述限制性酶识别位点、和与F1c相同的序列的引物；和B)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与R2相同的序列、所述限制性酶识别序列、和与R1互补的序列R1c的引物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述合成DNA的步骤包括采用一种退火至比所述内部引物更接近3’一侧的部分上的外部引物。
7.权利要求1到6中任一项所述的方法，其中在所述切割位点上由所述限制性酶所产生的单链区至少包含5个碱基。
8.权利要求1到6中任一项所述的方法，其中在所述切割位点上由所述限制性酶所产生的单链区至少包含7个碱基。
9.权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述引物与可检测性标记物或固相结合，或经修饰而能够与之结合。
10.一种内部引物对，所述引物对包含以下A)和B)当按从所述双链DNA的第一条DNA链上所述靶序列的3’端到所述DNA链的3’端的顺序选择第一任意序列F1c和第二任意序列F2c，并且按从所述靶序列的5’端到所述DNA链的5’端的顺序选择第三任意序列R1和第四任意序列R2时，则为A)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2和与F1c相同的序列的引物，或者一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与F2c互补的序列F2、下述限制性酶的识别位点、和与F1c相同的序列的引物，其中所述限制性酶a)能形成具有突出3’末端的片段，且b)能进行切割，以便使得在所述切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不同；和B)一种按从3’一侧到5’一侧的顺序含有与R2相同的序列、所述限制性酶的识别序列、和与R1互补的序列R1c的引物。
11.一种用于合成单链核酸的载体，所述载体在克隆位点中或邻近克隆位点包含下述碱基序列，其中所述碱基序列用限制性酶以这样一种方式切割，使得a)形成带突出3’末端的片段，且b)在所述切割后所述片段单链区的碱基序列彼此不相同。
12.一种用于合成单链核酸链的试剂盒，所述试剂盒至少包括以下试剂1)一种限制性酶，所述限制性酶a)能形成具有突出3’末端的片段，且b)能够进行切割，以便使得片段的碱基序列彼此不同；2)一种能够退火至经所限制性酶切割出的所述DNA片段单链区上的引物；3)一种链置换型聚合酶；和4)权利要求10所述的内部引物或者权利要求11所述的用于合成单链核酸的载体。
全文摘要
选择性和有效地合成双链核酸中的有义链和反义链中的一条链的方法。这种合成单链核酸的方法包括下列步骤1)用一种限制性酶，以这样的方式切割在靶序列5’一侧中具有一个限制性酶识别序列的双链DNA，使得a)形成具有突出3’末端的片段，且b)在所述切割后所述片段的单链区的碱基序列彼此不同；2)让至少在3’端具有与所述DNA片段中通过所述限制性酶切割而获得的单链区互补的碱基序列的引物，退火到所述单链区上；且3)用一种链置换型聚合酶从所述引物的3’末端开始，合成单链核酸。通过采用LAMP反应，扩增具有上述限制性酶识别位点的双链DNA，可以更加有效地合成单链核酸。
文档编号C12Q1/68GK1483078SQ01821241
公开日2004年3月17日 申请日期2001年10月26日 优先权日2000年10月27日
发明者长岭宪太郎, 长谷哲, 纳富继宣, 宣 申请人:荣研化学株式会社