专利名称：使用磁性产生的机械压力进行组织培养的制作方法
技术领域：
本发明涉及培养细胞的方法，更具体涉及(但并不局限于)培养细胞生成人类或动物组织替代物的方法。本发明甚至更具体涉及，但并不局限于，机械应答组织的培养方法。
体外培养人类和动物的替代组织是一个重要的发展，该技术是使取自患者的细胞生长为组织，因而该替代组织不会引起排斥问题。可用于替代治疗的替代组织的实例包括结缔组织、骨、软骨、肌腱、胰腺。
替代组织不一定仅限于由同一类型的细胞组成，因为该组织除要实现替代外还必须具有符合要求的、尽可能复杂的三维形状。这样，替代组织通常生长在形状合适的支架上或内部，该支架浸没在生物反应器的培养基质中。支架是细胞生长的支撑，其提供了使组织生长为所需的三维形状。培养基质在生物反应器内流动(通常恒定)，保证了在支架上或内部的组织生成细胞持续得到营养的供应，并且细胞的代谢废物被清除。和静态的培养瓶相比，生物反应器中的培养基质的量的增加，使得适合许多不同组织生长的各种不同大小范围的支架可以浸没在培养基质中。培养基质充满了支架，使得支架结构内的所有细胞得益于生存和生长的良好环境。
此外，尤其是在对机械力反应的组织中，在培养成为具有全功能组织的过程中，很有必要使组织生成细胞经受机械压力。这样，比如，一些结缔组织如骨、软骨、韧带和肌腱，应该在培养过程中经受机械压力，以获得所需的机械性能。
所需压力的大小根据所用细胞类型和所需组织类型而变化，产生这些压力的各种方式是本领域中已知的，包括对细胞的直接机械刺激和水力加压系统。所述前一方法用滚筒或类似物压迫细胞，而后一方法在培养基质中增加脉冲压力，给生物反应器中的细胞提供机械刺激。但是，以机械方式刺激细胞产生功能组织的已知方法还没有一种可令人十分满意地用于多种类型组织，如骨、肌腱和韧带等。直接的机械刺激方法很麻烦，给细胞培养所需的无菌条件造成了困难。水力压缩方法通常无效。而且，所有以前的方法都有一个缺点，即在任一时刻，施加在所有培养细胞上的压力大小只有一种，(通常比细胞水平所需的压力要大得多)，而且细胞生长所用的支架自身必须有相当大的机械抵抗力来承受施加在其上的压力。
所以本发明的一个目标是消除或减小上述的缺点。
按照本发明的一个方面，本发明提供了一种组织培养的方法，该方法包括组织生成细胞生长的同时，向该细胞施加由磁性产生的机械压力。
这样按照本发明，磁性产生的压力被施加到组织生成细胞上，以保证生产出全功能的组织。
本发明的方法可以用于体外培养患者移植用组织。
如果在体外实施，最好将组织生成细胞在三维支架上或其内部培养，较优选的方式是培养在有组织培养基流动穿过的生物反应器中。其它类型的组织培养容器也可以应用。本发明的方法也可用于在患者体内进行原位新生组织的培养。
所述压力可由磁性材料产生，磁性材料响应施加在生物反应器中的磁场产生力，并将该力传递给培养中的组织生成细胞，从而给该细胞施加了所需的压力。在本发明的优选的实施例中，磁性材料以微米级或纳米级的微粒附着在组织生成细胞上，较优选的为磁性材料包被的微米或纳米级微粒。另一种选择是，磁性材料可以是掺入培养基中的铁磁流体。另外还可联合使用铁磁流体和附着在细胞上的磁性材料。
不考虑使用的特定磁性材料，通过随时间变化的磁性梯度或均一的磁场来调节磁性材料的运动，从而给组织生成细胞重复地施加压力。所述压力可以在强度和施加方向两方面精确变动，从而可使组织生成细胞能接受到所需的压力，确保生成全功能组织。这些可通过改变同一支架不同区域(或不同的支架)的不同细胞上附着的微粒的磁性来实现，或通过在梯度磁场中应用磁场强度的空间变化来实现。
磁场可以在某一个频率范围内变化，比如0.1-10赫兹，但是，也可使用该范围以外的频率。常用的磁场通量密度范围为(但不限于)10mT到1400mT。
施加在细胞上的压力的大小范围为(但不限于)0.1到100皮牛(piconewtonpN)，所施加压力的方向可由磁性材料在施加的磁场中的直线迁移(linear transitional motion)(由于有梯度，所以微粒无需磁阻隔(magnetically blocked))，或者旋转运动(由于微粒的磁化载体和磁场的夹角，因而必须是磁阻隔微粒)决定。
本发明的显著的进步是(如所示)容易控制施加压力的大小和方向，同时保持体外无菌条件，例如在生物反应器中或体内，这一现象的原因是磁场变化可以遥控。而且，细胞水平产生的压力通常很小，(例如，几个皮牛)[3]，如此，任何支架(组织生成细胞在其上或内生长)不需要强化的机械性能。
本发明的方法可以用来在生物反应器中和体内生产各种类型的组织，在体内则需要机械施压(mechanical loading)或活化对机械力敏感的离子通道。这包括(但不限于)结缔组织比如骨、软骨、韧带和肌腱。待培养的细胞的活组织检查可以通过标准程序进行[4]。
本发明的方法也可用于由至少两种不同类型组织构成的组织构件，例如骨和软骨。也可用间叶细胞样的干细胞作为来源，这些干细胞在支架上或内部原位分化为软骨细胞或骨细胞。
如上所述，本发明的优选实施方案包括将微米或纳米级的磁性微粒附着在组织生成细胞上，目的是施加所需的压力。可以先将微米和纳米级的磁性颗粒功能化并附着于组织生成细胞上，然后将该组织生成细胞种植在供组织生长于其上或其中的支架上。这样，例如，微米和纳米级的颗粒可以以粘连分子包被，比如纤连蛋白分子和RGD分子用于附加在细胞上。
微米和纳米级的微粒(打算附加在细胞上)是球形或椭圆形的，直径在10nm到10um范围内。
附加到细胞上的微粒可以包被或不包被，有一个或多个磁畴，合适的微粒包括但不限于(i)包被的磁性微球(d＝4cm)从Spherotech公司获得。这些微球体由磁性被封闭的核心和包被其的聚合物组成。(ii)单磁畴，涂抹有铁酸盐的二氧化硅纳米颗粒，大小可调(d＝50-300nm)，并且大小分布范围窄[5]。
但是，磁性材料并不一定要微粒状，而且也不一定要附着在细胞上。例如，对于生物反应器或体内有充足培养基时，可以让培养基中包含铁磁流，该铁磁流在梯度磁场的作用下产生的力作用于所培养的细胞。铁磁流体可以是，例如，PVA/磁铁矿纳米颗粒级的铁磁流体(d＝4-10nm)[6]。也可将附着在细胞上的微粒和铁磁流体联合使用。
生物反应器可以是，例如，现有生物反应器的改进，例如profusion，旋转瓶(spinner flask)，水力加压和旋转容器系统。
为方便起见，让磁场产生在组织培养容器的外部(如果所述方法是在体外应用)，或者当该方法在体内应用时，让磁场产生在体外。磁场可由永久磁铁或电磁铁产生。为了产生可变化的磁场，永久磁铁可相对于培养的细胞移动。因此，在生物反应器中，所述运动可以，例如，沿着反应器的纵轴进行，朝向和远离反应器或围绕反应器运动。这些运动也可结合使用。和永久磁铁方式相同，在电磁铁中，给电磁铁提供合适水平的电流并有选择的和电磁铁的运动结合可以产生变化的磁场。
可以使用并可购买到的磁铁的实例包括钕-铁-硼和钐-钴永久磁铁，它们能够产生所需的磁场梯度和磁通量密度。它们可以几何学上制作，并磁化成为所需的规格，并在表面产生的磁通量密度高于1T(10,000高斯)。可用的电磁铁的实例包括冷冻、超导的磁性线圈，该线圈可以产生几个特斯拉的磁场。
施加在细胞上的磁力通常从0.1到10pN(如前所述)，这样的力量可以打开跨膜离子通道。产生所需磁力的磁场及磁场梯度的变化随微粒磁性、体积和形状特性以及组织构件和磁铁间的距离的不同而变化。这些参数符合如下的公式Fmag=(x2-x1)V1μ0B(▿B)]]>当x2是磁性微粒的体积磁化率，x1是周围基质(例如，组织/骨)的体积磁化率，μ0是自由空间的磁透性。B是磁通量密度，单位为特斯拉(T)。虽然这些呈球形的微粒没有磁偶极相互作用，但应当接近所需的磁场和磁场梯度。
因为和磁铁矿(或其他应用在铁磁流体中的磁性材料，纳米颗粒)的磁化率相比，人类组织的x1的值非常小而且是负的，x1在计算时可以忽略，(x2-x1)的表示可以简化为x2，而且，我们对磁铁矿颗粒/铁磁流体/材料在施加的磁场中沿着Z轴(竖直)的直线运动感兴趣，假定相对的磁透性为1，磁力的表达可以简化为Fmag=(x2)VBdBdZ]]>对靠近磁场源的颗粒来说。
从公式中可以看到，铁磁流体和磁性颗粒给组织构造带来的压缩力(线性的)依赖于磁场强度、磁场梯度、颗粒的体积性质和磁性性质。
这些参数其中之一具有很强的空间变化，是磁场强度和梯度的产物。这为在三维方向施加有差异的磁力提供了可能。此外，可以通过在支架的不同区域种植具有不同磁性及体积特性的魏丽、铁磁流体和磁性材料，来加强所施加力的三维变化。通过施加在生物反应器内的磁力的空间差异，促进了复杂组织结构的生长。
多种不同类型的支架(三维的多孔的块状，各方向都可变化)都可使用。本发明的优点是由于支架所受的压力很小，所以不需要强化的机械性能。例如可以应用一个生物可降解的、多孔的PLA支架。另一种可选择的支架包括可迅速降解的、机械强度不强的PGA(多聚乙醇酸)材料支架，和天然材料胶原支架[7]。支架外可以包裹I型胶原或其他粘连分子(例如RGD或非RGD的分子)提高细胞的黏着力。
通过实施例结合附图对本发明做出说明，其中
图1说明了本发明的第一个实施例图2说明了本发明的第二个实施例图3说明了使用磁场后，对机械力敏感的跨膜离子通道的活动。
图1图示的是一个管状的生物反应器1，其连接一永久磁铁2，永久磁铁2置于反应器外，并安装在载体3(carrier arrangement)上，载体3和计算机控制(或其他随时间改变的)的驱动系统相连，此系统在图中没有详细显示。
在生物反应器1内，是大量在纵轴上分布的组织构件4，每一构件都图示为包括一端(远离磁铁3的一端)的骨组织和另一端的软骨组织(其他组织类型也可使用)。组织中的细胞其上附着有磁珠(图中未标示)，且细胞被种植在三维支架上(也没有标示)。箭头5描述了给生物反应器提供营养物，箭头6描述了营养物流出反应器。
反应器外部共有4个磁铁2(为了与组织构件数量匹配，此数量可以变化)，沿着纵轴放置。磁铁的位置是这样，磁铁与组织构件一一对应，且在软骨的一侧。
在使用装置时，载体被驱动，其目的是振荡磁铁，使之横向接近和远离反应器。磁铁被驱动的振荡频率通常会变化，并在0.1-10赫兹的范围内，虽然也可以应用超出此范围的值。
磁铁的振荡引发了施加到组织构造的压缩和放松循环，也可通过附加在磁铁上的机械驱动(图上没有标示)改变振荡频率。磁场梯度(空间变化的磁场强度)保证了软骨承受的磁通量密度比骨细胞稍微高些。
强的磁场梯度将导致纳米颗粒朝向磁铁进行平移直线运动，压缩生物反应器中的细胞和支架，这种压缩不需要与生物反应器中的细胞直接接触即可刺激机械施压。改变磁场强度和梯度、磁铁位置和/或压缩组织构件纳米颗粒的物理性质就可以很容易地改变载荷。
如果需要，和骨细胞相连的磁性颗粒可以与软骨相连的磁性颗粒具有不同的磁性性质，以便可在两种不同类型的细胞上施加不同的机械压力。
图2图示说明了改进的图1中所示的仪器。在图2中，永久磁铁沿着生物反应器的纵轴平行振荡(而不是图1中所示的横向振荡)。
图示的实施例可以做出许多改变。
例如，磁铁可以相对于生物反应器环绕运动，达到此目的的最简便的但并不是必需的办法就是磁铁固定，生物反应器围绕其纵轴旋转。
此外，图1和图2中永久磁铁可以被电磁铁替代。附着在细胞上的纳米颗粒进一步可以被铁磁流体替代。如果需要，纳米颗粒和铁磁流体可以联合使用。
为了使整个支架变形，可以进一步运用能够吸引到磁铁上的磁性/金属板或其他结构。
给出的图3是为了说明另一种活化机械力敏感的跨膜离子通道的方法，该方法使用磁场引发组织构件的周期性机械荷载。
更具体地，图3显示细胞10具有细胞膜11，细胞膜11靠近细胞质12，在细胞膜11内是一个对机械力敏感的离子通道13。功能化的磁阻隔的颗粒14(比如Sphereotech公司的包被的铁磁体颗粒d＝4.5um)直接或间接通过细胞骨架偶联固定在细胞膜11上。
在图3显示的情况下，细胞10上没有施加磁场，离子通道是关闭的。
通过振荡磁场源(没有标示)，附着到细胞10上的磁性微粒14能够被扭动，给细胞膜11施加机械压力，从而活化了对机械敏感的通道13(图3b)。该离子通道的活化启动了培养细胞中的生物化学反应途径，而且引发了生物反应器内的组织构件的周期性机械荷载。
参考文献1.Ying，Y.，Peak，M.，Magnay，J.，and El Haj，A.J.(2000)Dynamic cellscaffold interactionsimplications for tissue engineering.Proceedings of thesecond Smith and Nephew international symposium on tissue engineering，York，UK.2.El Haj，AJ，LM Walker，MR Preston，SJ Publicover(1999)Mechanotransduction pathways in bonecalcium fluxes and the role ofvoltage-operated calcium channels.Med.Biol.ENG.COMP.，37403-409.3.Howard J and AJ Hudspeth(1989)Compliance of the hair bundleassociated with the gating of mechanoelectrical transduction channels in thebullfrog′s saccular hair cell.Neuron 1189-199.4.Walker et al J Cell Biochem 2000.5.Pardoe，H，W Chua-anusom，TG St.Pierre，J Dobson(2000)Structuraland magnetic properties of nanoscale magnetic particles synthesised bycoprecipitation of iron oxide in the presence of dextran or polyvinyl alcohol.J.Magn.Mag.Materials.In Press.6.Tan，W，S Santra，Z Peng，R Tapec and J Dobson(2000)Coatednanoparticles.US Patent Pending(Filed May 17，2000).7.Sittinger et al 1996.8.Kirschvink，JL(1992)Comments on“Constraints on biological effects ofweak extremely-low-frequency electromagnetic fields”.Phys.Rev.A.462178-2184.9.Dobson，J and TG St.Pierre(1996)Application of the FerromagneticTransduction Model to D.C.and Pulsed Magnetic FieldsEffects onEpileptogenic Tissue and Implications for Cellular Phone Safety.Biochem.Biophys.Res.Commun.，227718-723.
权利要求
1.一种组织培养方法，该方法包括在培养组织生成细胞的同时，向所述组织生成细胞施加机械压力，其特征在于所述机械压力是由磁性产生。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述压力由磁性材料产生，所述磁性材料响应所施加的磁场产生力并将所述的力传递给所述组织生成细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述磁性材料附着在所述组织生成细胞上。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述磁性材料包括微米或纳米级颗粒。
5.根据权利要求2到4中任何一个权利要求所述的方法，其中所述磁性材料包括铁磁流体。
6.根据权利要求1到5中任何一个权利要求所述的方法，其中在培养所述组织生成细胞过程中，所述磁场是变化的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述磁场以正弦曲线变化。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述磁场变化的频率范围为0.1到10赫兹。
9.根据权利要求1到8中任何一个权利要求所述的方法，其中所述的方法在体外应用。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述组织生成细胞在三维支架上或内部生长。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述组织生成细胞培养在有组织培养基流动穿过的生物反应器中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述磁场是从所述生物反应器外部施加的。
13.根据权利要求1到8任何一个所述的方法，其中所述的方法在体内进行。
14.根据权利要求1到13中任何一个所述的方法，其中所述被培养的细胞用来形成粘连组织。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述被培养的细胞用来形成骨、软骨、韧带和肌腱。
16.根据权利要求1到15任何一个权利要求所述的方法，其中所述被培养的细胞为两种或更多种类型不同的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在不同类型的细胞上施加不同的压力。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述被培养的细胞包括成骨细胞和成软骨细胞。
19.根据权利要求1-18任何一个权利要求所述的方法，其中施加给所述细胞或支架的力在0.01到100皮牛。
20.一种具有培养基入口和出口的生物反应器，该生物反应器提供在所述生物反应器中产生变化磁场的装置。
21.根据权利要求20所述的生物反应器，其中所述的在生物反应器中产生变化磁场的装置包括电磁铁。
22.权利要求21所述的生物反应器，其中所述的在生物反应器中产生变化磁场的装置包括至少一个永久磁铁，所述永久磁铁可相对所述生物反应器移动。
全文摘要
一种组织培养的方法，包括培养组织生成细胞，同时使组织生成细胞经受磁性产生的机械压力。
文档编号C12N5/06GK1483075SQ01821270
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月19日 优先权日2000年12月22日
发明者艾丽西亚·詹尼弗·哈菲兹·艾尔－哈吉, 乔恩·保罗·多布森, 保罗 多布森, 艾丽西亚 詹尼弗 哈菲兹 艾尔-哈吉 申请人:基尔大学