肝衰竭预后的gstm3基因甲基化定量检测法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒。它是一种定量检测谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲基化程度的方法和装置。试剂盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂，对基因组DNA进行修饰的试剂，5×预混PCR反应体系，以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针。通过目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和探针，对外周血基因组DNA进行实时定量聚合酶链式（PCR）反应,用定量甲基化特异性PCR的方法检测目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4的阈值循环值，并计算出基因GSTM3甲基化定量值。有助于评估病情、判断预后及指导治疗。
【专利说明】肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，是一种检测与肝衰竭预后相关基因甲基化程度的检测法及试剂盒，尤其是一种定量检测谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲基化程度的检测法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]慢加急性肝衰竭(ACHBLF)是以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病及腹水等为主要表现的一组临床症候群。它发生在慢性肝病的基础上，是由多种因素引起的大面积肝细胞坏死或严重肝损害，导致肝脏合成、排泄、生物转化与解毒等功能发生严重障碍或失代偿。慢加急性肝衰竭可由多种原因诱发，在我国其主要病因是慢性乙型肝炎(CHB)。乙型肝炎重症化由多基因、多因素所致，其发病机制非常复杂。目前研究表明，重症乙型肝炎的发生和发展主要由病毒和宿主两大因素相互作用所致。同时，乙醇、药物、化学毒物、生物毒物、乙肝病毒(HBV)耐药变异、免疫抑制剂及合并感染等因素也被证实能够导致慢性HBV感染者的急性发病,表现为慢加急性肝功能衰竭,称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎(ACHBLF)。该疾病病情凶险，进展迅速，国内外报告的病死率高达60%-80%，预后差，且临床上并无有效评估病情、判断疗效和预测预后的体系，其临床救治仍是医学难题。因此，揭示乙型肝炎重症化的机制，建立有效的综合评估预后体系，制订有效的防治手段具有重大意义。
[0003]研究表明，表观遗传在慢性HBV感染的重症化过程中发挥重要作用，已逐渐成为医学领域的研究热点。其研究范畴主要包括脱氧核糖核酸(DNA)甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控。其中，DNA甲基化是表观遗传学的重要调控机制之一，它是在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸中的甲基转移至胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。在人类基因组中，CpG序列出现率仅1%，但在某些区域存在鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成CpG岛。而甲基化则主要发生于CpG岛的胞嘧啶上。CpG岛的甲基化可使基因沉默、失活，影响基因转录，调控基因表达，而非甲基化则与基因活化密切相关。研究证实，感染HBV的宿主均存在DNMT表达上调的现象，因此，HBV可通过增强DNMT的活性，促使病毒DNA启动子发生甲基化，抑制病毒DNA转录，从而抑制病毒的复制。 [0004]肝衰竭患者体内存在不同程度的氧化损伤。氧化损伤在肝衰竭的发生发展过程中发挥重要作用。谷胱甘肽S-转移酶(GST)是主要存在于肝细胞内的II相代谢酶，可促进谷胱甘肽与毒性代谢产物结合，清除细胞内自由基，可使有害的亲电物质与谷胱甘肽结合，将其排出体外，从而发挥保护机体核酸和蛋白质的功能。GST超家族主要有4个亚家族一 a、
i1、J1、0，分别为GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。其中，谷胱甘肽S-转移酶M3 (GSTM3)是U亚家族的重要成员之一，它在与环境致癌物质的结合与脱毒过程中作用巨大，同时也具有极强的抗氧化能力。研究表明，GSTM3基因甲基化程度与其表达水平间存在明显的负相关。GSTM3基因启动子的高甲基化可以使GSTM3表达减低，进而导致机体抗氧化能力减低，氧化损伤加重，正常的肝功能受损。甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)法是目前应用最为广泛的DNA甲基化检测方法，具有较强的特异性、敏感性和可操作性。但是MSP-PCR只能作定性研究且其聚合酶链反应(PCR)条件需严格控制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种能定量检测与肝衰竭预后相关的谷胱甘肽S-转移酶M3 (GSTM3)基因甲基化程度的检测方法及试剂盒，为肝衰竭的临床诊断和治疗提供科学依据。
[0006]本发明是这样实现的，肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂，5 X预混PCR反应体系，以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针:
GSTM3-上游引物:5’ CGTACGGTTTTGTGGAGTC 3’ ；
GSTM3-下游引物:5’ TCCGAACCTTCGAAAACTAA 3’ ；
GSTM3-探针:5，Fam AAACCCACGCGCGAACGCC 3’ BHQl ；
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’ ；
ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’ ；
ALU-C4-探针:5’ Fam CC TACCTTAACCTCCC 3’ BHQI。
[0007]为了便于质控，本试剂盒内还设有标准品，阳性对照及阴性对照。
[0008]肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其步骤为:首先，提取待测样本外周血基因组DNA，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰，分别用目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针序列，对处理过的DNA进行实时定量聚合酶链式(PCR)反应，其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得，实时定量甲基化特异性PCR方法对目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4进行扩增；以标准品的扩增结果制备标准曲线；采用实时定量甲基化特异性PCR的方法，同时对重亚硫酸盐处理后的样品DNA分别检测目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4的阈值循环值，计算出目的基因GSTM3甲基化程度的定量值。
[0009]采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板。
[0010]通过荧光PCR仪获得各PCR反应管的甲基化反应的阈值循环值，其GSTM3甲基化的计算公式为:甲基化率=100%X 2 exp-[ A Cp (样品GSTM3 Cp值-样品ALU-C4 Cp值)-A Cp (阳性对照GSTM3 Cp值-阳性对照ALU-C4 Cp值)]。
[0011]本发明应用基于Taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性聚合酶链反应检测方法率先对不同预后的慢加急性肝衰竭患者的外周血基因组DNA进行了检测，首次发现GSTM3基因启动子在慢加急性肝衰竭死亡组患者中甲基化程度高，提示GSTM3基因启动子的甲基化程度与肝衰竭患者的预后密切相关。对GSTM3基因启动子的甲基化进行定量检测可以提示重症肝炎患者预后， 指导临床医师治疗。
[0012]甲基化特异性聚合酶链反应(MSP-PCR)法是目前应用最为广泛的DNA甲基化检测方法，具有较强的特异性、敏感性和可操作性。但是MSP-PCR只能作定性研究且其聚合酶链反应(PCR)条件需严格控制。本发明应用基于Taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性PCR检测方法，可克服MSP-PCR定性检测的缺点，消除非特异性扩增，更好的避免DNA污染对结果的影响，确保检测结果的特异度。基于Taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性PCR是利用荧光标记的Taqman荧光探针追踪PCR产物，实时反映甲基化特异性PCR过程，利用相关软件对甲基化特异性PCR产物进行分析，从而得到待测样本的初始模板量。该检测方法能够检测到人体外周血中极微量的DNA，灵敏度高，特异性强，适用于检测DNA含量少、损失率高的标本。此外，本发明标本取自慢加急性肝衰竭患者外周血，取材方便，操作简便且病人创伤小。本发明采用试剂盒组装，相较其他检测技术，具有检测快速、结果准确、直观等优点，可作为临床医师评估慢加急性肝衰竭患者预后及指导治疗的依据。
[0013]本发明利用谷胱甘肽S-转移酶M3基因的启动子甲基化程度与重症肝炎的预后存在的密切关系，利用试剂盒和谷胱甘肽S-转移酶M3基因的启动子甲基化的定量检测方法完成的本发明，可作为辅助慢加急性肝衰竭诊断、疗效观察、预后判断及指导治疗的有力手段。而且，采用本发明的方法和试剂盒对慢加急性肝衰竭患者GSTM3基因启动子甲基化状态进行检测，具有操作简便、灵敏度高、结果准确可靠、稳定性好的优点，具有深远的临床意义，适于大规模推广应用。本发明利用一个试剂盒就可以做到由采血到定量检测与肝衰竭预后相关的GSTM3基因甲基化程度的全过程，方便、快捷、适用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
图1为GSTM3标准品测序图。
[0015]A:腺嘌呤；T:胸腺嘧啶；G:鸟嘌呤；C:胞嘧啶。GSTM3标准品为包含GSTM3目的基因片段的质粒，即，对目的基因片段进行PCR反应扩增，PCR产物纯化后连接入T载体，转化至工程菌内，进行扩增测序。从测序验证正确的重组菌中提取纯化质粒，作为GSTM3标准品。
·[0016]图2为GSTM3实时定量甲基化特异性PCR检测扩增曲线和标准曲线。
[0017]Amplification Curves:扩增曲线；Cycles:循环数；Fluorescence:突光；Standard Curve:标准曲线；Crossing Point:阈值循环值；Log Concentration:对数浓度；Error:误差！Efficiency:扩增效率。将GSTM3标准品依次等比梯度稀释(扩增曲线中自左向右标准品浓度递减)，作为DNA模板进行实时定量甲基化特异性PCR反应，制作GSTM3甲基化表达的标准曲线。软件计算GSTM3甲基化特异性扩增效率为1.929。
[0018]图3为ALU-C4实时定量甲基化特异性PCR检测扩增曲线和标准曲线。
[0019]将ALU-C4标准品依次等比梯度稀释(扩增曲线中自左向右标准品浓度递减)，作为DNA模板进行实时定量甲基化特异性PCR反应，制作ALU-C4甲基化表达的标准曲线。软件计算ALU-C4扩增效率为1.993。
[0020]图4为慢加急性肝衰竭患者基因组DNA GSTM3实时定量甲基化特异性PCR检测扩增曲线。
[0021]Amplification Curves:扩增曲线；Cycles:循环数；Fluorescence:突光。利用GSTM3甲基化特异性引物及探针，扩增一例死亡患者(14号标本)、一例存活患者(28号标本)、阳性对照及阴性对照标本，获得各标本目的基因GSTM3甲基化特异性扩增曲线，软件分析各标本阈值循环值(Cp值)。[0022]图5为慢加急性肝衰竭患者基因组DNA ALU-C4实时定量甲基化特异性PCR检测扩增曲线。
[0023]利用ALU特异性引物及探针，同时扩增一例死亡患者(14号标本)、一例存活患者(28号标本)、阳性对照及阴性对照标本，获得各标本内参基因ALU特异性扩增曲线，软件分析各标本阈值循环值(Cp值)。根据甲基化率计算公式，计算得到14号标本甲基化率为98.62%, 28号标本甲基化率为29.94%。
[0024]图6为不同预后慢加急性肝衰竭患者GSTM3基因启动子甲基化程度的比较。
[0025]50例慢加急性肝衰竭患者中存活27例，死亡23例，存活患者甲基化率为(17.75%±15.15%，均数土标准差)，死亡患者甲基化率为(42.42%±30.84%)。死亡患者甲基化率明显高于存活患者(P〈0.01)。
[0026]图7为GSTM3基因启动子甲基化定量程度用来判断慢加急性肝衰竭患者预后的受试者特征工作曲线。
[0027]Sensitivity:敏感性！Specificity:特异性；AUR0C:受试者工作特征曲线(ROC)下面积。选取截断点为甲基化率40.90%，GSTM3甲基化率判断慢加急性肝衰竭预后的ROC曲线下面积为0.750 (95%可信区间:0.607-0.861)，敏感性为60.87 (95%可信区间:38.5-80.3)，特异性为96.30 (95%可信区间:81.0-99.9)，阳性预测值为93.3 (95%可信区间:68.1-99.8)，阴性预测值为74.3 (95%可信区间:56.7-87.5)。
[0028]【具体实施方式】
为更详细地阐述本发明，下面结合附图和实施例对本发明的具体方法作进一步说明:GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂；对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂；·5X预混PCR反应体系；以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针:
GSTM3-上游引物:5’ CGTACGGTTTTGTGGAGTC 3’ ；
GSTM3-下游引物:5’ TCCGAACCTTCGAAAACTAA 3’ ；
GSTM3-探针:5，Fam AAACCCACGCGCGAACGCC 3’ BHQl ；
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’ ；
ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’ ；
ALU-C4-探针:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQI。
[0029]5 X预混PCR反应体系为市场出售产品，其中含有热启动Taq聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、PCR反应的增强剂、优化剂以及稳定剂。
[0030]为了便于质控，本试剂盒内还设有标准品，阳性对照及阴性对照。
[0031]本试剂盒中设有的标准品为包含目的基因片段的质粒。即，对目的基因片段进行PCR反应扩增，PCR产物纯化后连接入T载体，转化至工程菌内，进行扩增测序。从测序验证正确的重组菌中提取纯化质粒，作为GSTM3标准品。将依次等比梯度稀释的标准品作为DNA模板，进行实时定量甲基化特异性PCR反应，制作标准曲线。标准曲线提供了扩增效率、重复一致性及反应的理论检测限等信息，可以用来评估PCR效率、灵敏度和可重复性，可以为PCR反应提供质量控制。
[0032]本试剂盒中设有的阳性对照为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得。
[0033]本试剂盒中设有的阴性对照为双蒸馏水。
[0034]肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其步骤为:
1.基因组DNA提取
抽取慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周静脉血。可以应用硅胶膜离心柱吸附法(采用核酸纯化试剂盒，QIAamp DNA Blood MiniKit，货号:51104)提取基因组DNA，也可以用酚氯仿手工提法、溶液型试剂盒方法等其他方法提取DNA。硅胶膜离心柱吸附法步骤如下:
(1)向装有20W蛋白酶的离心管中加入200W全血；
(2)加入200W裂解缓冲液，脉冲式涡旋15秒混匀；
(3)56°C孵育10分钟，短暂离心以移除附于管盖内的液体；
(4)加入200W乙醇(96-100%)于微量离心管中，脉冲式涡旋15秒混匀，短暂离心以移除附于管盖内的液体；
(5)将上述混合液加入离心柱中(置于收集管中)，6000Xg离心I分钟，换入新的收集
管中；
(6)加入500W漂洗缓冲液1，6000Xg离心I分钟，换入新的收集管中； (7)加入500W漂洗缓冲液2，20000Xg离心3分钟；
(8)离心柱放入一个新的微量离心管中，加入200W洗脱缓冲液或蒸馏水，室温(15-25°C)孵育I分钟，6000 Xg离心I分钟，收集DNA提取液；
(9)将收集到的DNA提取液经核酸测定仪测得DNA浓度及纯度，_20°C存放备用。
[0035]抽取慢加急性肝衰竭(ACLF)患者外周静脉血。也可以用酚-氯仿抽提、溶液型试剂盒等方法提取DNA。酚-氯仿抽提法提取DNA所需主要试剂包括苯酚、异丙醇、乙醇、蛋白酶K、磷酸盐缓冲液等；溶液型试剂盒法提取DNA所需主要试剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-Cl )、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰核糖核酸(RNA)酶、异丙醇、乙醇等。
[0036]2.重亚硫酸盐修饰
采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板，即:用重亚硫酸盐处理和转化提取的基因组DNA样品(采用甲基化DNA转化试剂盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit 货号:D5005)。步骤如下:
(1)配制转化剂:将900W水、300W稀释缓冲液和50W溶解缓冲液加入到转化剂管中，涡旋振动混匀；
(2)将130W转化剂加入到20ulDNA样本中；
(3)将样本放在PCR仪中，98°C孵育10分钟，64°C孵育2.5小时，可4°C贮存；
(4)将600W结合缓冲液加入离心柱中，置于收集管中；
(5)将来自第2步的样本加入装有结合缓冲液的离心柱中，盖紧管盖反复颠倒混匀；
(6)最高速O1000OXg)离心30秒，弃掉滤液；
(7)将100W洗涤缓冲液加入上述离心柱中，最高速离心30秒； (8)将200W脱磺化缓冲液加入离心柱中室温孵育15-20分钟，最高速离心30秒；
(9)将200W洗涤缓冲液加入离心柱中，最高速离心30秒。再加入200W洗涤缓冲液，最闻速尚心30秒；
(10)将离心柱加入微量离心管中，向离心柱中加入IOW洗脱缓冲液，最高速离心30秒以洗脱DNA ；
(11)分光光度计法测DNA浓度和纯度，保存于_20°C。
[0037]3.实时定量甲基化特异性聚合酶链式反应
针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针；实时定量甲基化特异性PCR方法对目的基因GSTM3启动子和内参基因ALU-C4进行扩增。
[0038](I)引物设计:
GSTM3引物对及探针:
GSTM3-上游引物:5’ CGTACGGTTTTGTGGAGTC 3’
GSTM3-下游引物:5’ TCCGAACCTTCGAAAACTAA 3’
GSTM3-探针:5’ Fam AAACCCACGCGCGAACGCC 3’ BHQl ALU-C4引物对及探针:
ALU-C4-上游引物:5’ GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’
ALU-C4-下游引物:5’ ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’
ALU-C4-探针:5’ Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’ BHQl
(2)实时定量甲基化特异性聚合酶链式反应检测GSTM3启动子甲基化程度:
分别用目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针序列，对处理过的DNA进行实时定量聚合酶链式(PCR)反应，其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得。反应体系如下表1:
表1实时定量甲基化特异性PCR反应体系
【权利要求】
1.肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒，其特征在于:盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂，5 X预混PCR反应体系，以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针:
2.根据权利要求1所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于:盒内设有标准品，阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于:该阳性对照为重亚硫酸盐修饰的100%甲基化的人基因组DNA。
4.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于:该阴性对照为高压的双蒸馏水。
5.根据权利要求2所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒，其特征在于:该标准品为包含目的基因片 段的质粒。
6.肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其步骤在于:首先，提取待测样本外周血基因组DNA，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰，分别用目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针，对处理过的DNA进行实时定量聚合酶链式(PCR)反应，其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得，实时定量甲基化特异性PCR方法对目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4进行扩增；以标准品的扩增结果制备标准曲线；采用实时定量甲基化特异性PCR的方法，同时对重亚硫酸盐处理后的样品DNA分别检测目的基因GSTM3和内参基因ALU-C4的阈值循环值，计算出目的基因GSTM3甲基化程度的定量值。
7.根据权利要求6所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其特征在于:采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板。
8.根据权利要求6所述的肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法，其特征在于:通过荧光PCR仪获得各PCR反应管的甲基化反应的阈值循环值，其GSTM3甲基化的计算公式为:甲基化率=100%X2 61?-[八0?(样品65110 Cp值-样品ALU-C4 Cp值)-ACp (阳性对照GSTM3 Cp值-阳性对照ALU-C4 Cp值)]。
【文档编号】C12Q1/68GK103525907SQ201310346483
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】王凯, 王丽媛, 赵静, 高帅, 孙丰凯, 范玉琛 申请人:山东大学齐鲁医院