%、85%、90%或95%序列同一性的肽。
[0099] 在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQIDN0 :2的氨基酸序列 (KVPESKVIFDANAPVAVRSKVPDS)。在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQID 勵：2〇^卩￡51^正0六嫩?￥六￥1?1^?05)具有至少约70%、75%、80%、85%、90%或95%序列同 一性但可在消化后形成T129肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，消化为胰蛋白酶消化。
[0100] 在一些实施方式中，甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用同位素标记，例 如，使用 13c、15n或二者。在一些实施方式中，标记的氨基酸残基是缬氨酸残基。在一些实施 方式中，甲状腺球蛋白肽标准品包括KVPESKVIFDANAPV*AV*RSKVPDS，其在胰蛋白酶消化后 产生K、VPESK、VIFDANAPV*AV*R(T-129-IS1)、SK和VPDS。
[0101] 以下实施例用来说明本发明。这些实施例绝不旨在限制方法的范围。 实施例
[0102] 实施例1:肽T129的MS宙量的说明
[0103] 从已知肽T129浓度的样品开始通过连续稀释制备几种具有各种已知浓度的肽 T129的样品。肽T129的L0Q和校准曲线由这些样品的LC-MS/MS分析产生。
[0104] 利用Phenomenex分析柱（PhenomenexCorp.Luna5uC8 (2) 100ANewColumn 50x1.0mm)进行LC。将由超纯水（HPLC级）中0.2%的甲酸（流动相A)和100%甲醇中 0.2%的甲酸（流动相B)组成的二元HPLC洗脱液施加至分析柱，以从样品中包含的其它物 质中分离所选Tg肽。二元洗脱液根据以下梯度形式施加：第一步，施加80/20的流动相A/ 流动相B混合物120秒；第二步，施加30/70的流动相A/流动相B混合物60秒；第三步，混 合物中流动相B的相对量在120秒的时间内渐变成5/95的流动相A/流动相B混合物；第 四步，施加5/95的流动相A/流动相B混合物60秒；第五步和最后一步，施加80/20的流动 相A/流动相B混合物240秒。
[0105] 然后，对分离的样品进行MS/MS，用于定量一种或多种具有相当于肽T129的m/z的 Tg肽。
[0106]使用FinniganTSQQuantumUltraMS/MS系统（ThermoElectronCorporation) 进行MS/MS。本文实施例中使用全部来自ThermoElectron的以下软件程序：TuneMaster V1.2或更新版本、XcaliburV2. 0SR1或更新版本、TSQQuantum1.4或更新版本、LCQuan V 2. 0或更新版本和XReport1. 0或更新版本。离开分析HPLC柱的液体溶剂/分析物流动 至ThermoFinniganMS/MS分析器加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热 管中转换成蒸汽。雾化溶剂中的分析物由界面的电晕放电针电离，放电针将电压施加至雾 化溶剂/分析物混合物。
[0107] 离子传递至第一四级（Q1)，第一四级选择具有636. 4 ±0.5的m/z的离子。进入四 极2 (Q2)的离子与氩气碰撞以生成离子碎片，其被传递至四极3 (Q3)用于进一步选择。表1 中显示用于在对正极性验证的过程中定量具有相当于肽T129的m/z的前体离子的质量转 变。
[0108]表1.具有相当于肽T129的m/z的前体离子的质量转变（正极性）
【主权项】
1. 确定试样中甲状腺球蛋白的量的方法，包括： (a) 消化所述试样中的甲状腺球蛋白和添加的同位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品， 以形成Tg肽和Tg肽标准产物； (b) 纯化来自步骤（a)的所述Tg肽和Tg肽标准产物； (c) 电离来自步骤（b)的所述Tg肽和Tg肽标准产物，以产生一种或多种可通过质谱法 检测的Tg肽离子和Tg肽标准产物离子； (d) 通过质谱法检测来自步骤（c)的一种或多种离子的量；其中步骤⑷中检测的一 种或多种离子的量与所述试样中甲状腺球蛋白的量和在步骤（a)中消化的甲状腺球蛋白 狀标准品的量相关；和 (e) 确定所述试样中甲状腺球蛋白的量，考虑步骤（d)中检测的Tg肽标准产物的离子 的量。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品长度小于50个氨基酸残 基。
3. 权利要求2所述的方法，其中Tg肽和Tg肽标准产物均包括T129肽（SEQIDNO:1， VIFDANAPVAVR)〇
4. 权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQIDNO:2的氨基 酸序列（KVPESKVIFDANAPVAVRSKVPDS)。
5. 权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQIDNO:2具有 至少约85%序列同一性的氨基酸序列，并可在步骤（a)的消化之后形成T129肽。
6. 权利要求3所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用13C、 15N或二者进行同位素标记。
7. 权利要求6所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个缬氨酸残基 是同位素标记的。
8. 权利要求1所述的方法，其中添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白肽 标准品的量是已知的。
9. 权利要求1所述的方法，其中考虑在步骤（a)的消化效率而调整所述试样中甲状腺 球蛋白的量，所述的消化效率由Tg肽标准品的量和添加至所述试样的所述同位素标记的 甲状腺球蛋白肽标准品的量之间的比率来测量。
10. 权利要求1所述的方法，其中在步骤（c)中产生的所述Tg肽离子包括选自 具有 541. 3±0. 5、612. 3±0. 5、636. 4±0. 5、726. 4±0. 5、797. 4±0. 5、912. 4±0. 5、或 1059. 5±0. 5的质荷比的离子的一种或多种离子。
11. 权利要求1所述的方法，其中所述电离包括生成具有636. 4±0. 5的质荷比的Tg肽 前体离子，和生成一种或多种选自具有797. 4±0. 5、912. 4±0. 5和1059. 5±0. 5的质荷比 的离子的碎片离子。
12. 权利要求1所述的方法，其中所述试样为体液或组织。
13. 确定试样中甲状腺球蛋白的量的方法，包括： (a) 消化所述试样中的甲状腺球蛋白，以形成肽T129,和消化在所述试样中添加的同 位素标记的甲状腺球蛋白肽标准品，以形成同位素标记的肽T129内标； (b) 纯化来自步骤（a)的所述肽T129和肽T129内标； (C)电离来自步骤（b)的所述肽T129和肽T129内标，以生成两种或更多种可通过串联 质谱法检测的前体离子；其中所述前体离子对肽T129具有636. 4±0. 5的质荷比； (d)在所述质谱仪器中碎裂所述前体离子，以生成一种或多种可通过质谱法检测的碎 片离子，其中肽T129的所述碎片离子的一种或多种选自具有797. 4±0. 5、912. 4±0. 5或 1059. 5±0. 5的质荷比的离子清单；和 (f)通过质谱法检测步骤（d)的所述前体离子、步骤（e)的所述碎片离子的一种或多 种、或二者的量； 其中步骤（f)中检测的一种或多种离子的量与所述试样中所述甲状腺球蛋白的量相 关。
14. 权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括SEQIDNO:2的氨 基酸序列。
15. 权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品包括与SEQIDNO:2具 有至少约85%序列同一性的氨基酸序列，并可在步骤（a)的消化之后形成T129肽。
16. 权利要求13所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个残基用 13C、15N或二者进行同位素标记。
17. 权利要求16所述的方法，其中所述甲状腺球蛋白肽标准品的一个或多个缬氨酸残 基是同位素标记的。
18. 权利要求13所述的方法，其中添加至所述试样的所述同位素标记的甲状腺球蛋白 肽标准品的量是已知的。
19. 权利要求13所述的方法，其中考虑在步骤（a)的消化效率而调整所述试样中甲状 腺球蛋白的量，所述消化效率由Tg肽标准品的量和添加至所述试样的所述同位素标记的 甲状腺球蛋白肽标准品的量之间的比率来测量。
【专利摘要】提供利用各种纯化步骤和随后的质谱法确定样品中甲状腺球蛋白的量的方法。该方法总体上涉及纯化试样中的甲状腺球蛋白、消化甲状腺球蛋白以形成肽T129、纯化肽T129、电离肽T129、检测生成的肽T129离子的量、和将肽T129离子的量与原始存在于样品中的甲状腺球蛋白的量相关联。
【IPC分类】C12Q1-37
【公开号】CN104797715
【申请号】CN201380060503
【发明人】Y·张, N·J·克拉克, R·E·赖茨
【申请人】奎斯特诊断投资公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年9月19日
【公告号】CA2885542A1, EP2898088A1, US9012394, US20140093899, WO2014047316A1