棉花事件pDAB4468.19.10.3的检测方法
【专利说明】棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的检测方法
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求2013年1月23日提交的、流水号61/589,594的美国临时专利申请 "除草剂耐受性棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3"的提交日的权益。
[0003] 发明背景
[0004] 编码AAD-12 (芳氧基链烷酸双加氧酶-12)的基因在转基因植物中表达时能够赋 予针对苯氧基乙酸除草剂2, 4-D和MCPA、以及吡啶氧基乙酸除草剂绿草定和氟草烟的商业 水平的耐受性。编码PAT(草胺膦乙酰转移酶）的基因在转基因植物中表达时能够赋予针 对除草剂草胺膦（草甘磷）的耐受性。PAT在棉花中已成功表达，既用作选择标记，还在转 基因植物中赋予针对除草剂草甘磷的商业水平的耐受性。
[0005] 大概由于染色质结构（例如，异染色质）或靠近整合位点的转录调控元件（例 如，增强子）的接近，已知转基因在植物中的表达受到它们在植物基因组中的位置的影响 (Weising等人，Ann.Rev.Genet22:421-477, 1988)。转基因在基因组中的不同位置处的存 在会以不同方式影响植物的整体表型。例如，已经在植物以及在其他生物中观察到导入基 因的表达水平在事件中可存在很大变化。在表达的空间或时间模式上也可能存在差异，例 如，转基因在各种植物组织中的相对表达的差异，这可能与根据导入基因构建体中存在的 转录调控元件预期的模式不对应。由于这个原因，通常产生几百个到几千个不同的事件并 筛选这些事件，得到具有所希望的转基因表达水平和模式的单个事件，用于商业目的。正因 如此，常常必需筛选大量事件，以便鉴定出其特征为导入的目的基因的优化表达的事件。具 有所希望的转基因表达水平或模式的事件对于使用常规育种方法通过有性异型杂交将所 述转基因渗入到其他遗传背景中是有用的。这种杂交的后代保持原始转化体的转基因表达 特征。这种策略用来在许多已很好适应当地生长条件的品种中保证可靠基因表达。
[0006] 想要的是能够检测出特定事件的存在，以便确定有性杂交后代是否包含一种或一 组目的转基因。另外，用于检测特定事件的方法将有助于遵守需要上市前许可的法规以及 源于重组作物植物的食物和纤维的标记，例如，或用于环境监测、监测大田作物的性状，或 监测源于作物收获的产品，以及用于保证受制于法规或合同条款的每一方的依从性。
[0007] 有可能通过本领域已知的任何核酸检测方法检测出转基因事件的存在，所述检测 方法包括但不限于聚合酶链式反应（PCR)或使用核酸探针的DNA杂交。这些检测方法通常 集中于频繁使用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标记基因等等，因为对于许多DNA构建 体而言，编码区是可互换的。结果，这样的方法对于在不同的事件特别是使用同样的DNA构 建体或非常相似的构建体所产生的那些事件之间进行区分可能是无用的，除非已知邻近插 入的异源DNA的侧翼DNA的DNA序列。例如，对于玉蜀黍事件DAS-59122-7的事件特异性PCR 测定法描述于美国专利申请2006/0070139中。具有用于鉴定棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的简单的判别性方法将是想要的。
[0008] 发明披露
[0009] 本发明的实施方案涉及用于检测新的抗昆虫且耐除草剂的转基因棉花转化事件 的方法，所述事件被指定为棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3,包括插入到棉花细胞的基因组内 的特定位点中的如本文中描述的aad-12和pat。代表性棉花种子已保藏于美国典型培养 物保藏中心（ATCC)，10801，大学大道（UniversityBoulevard)，马纳萨斯（Manassas)，维 吉尼亚州（VA)，20110。代表DowAgroSciencesLLC于2012年1月23日制作了所述保藏 物，指定为ATCC保藏号PTA-12457。依照关于用于专利程序目的的种子保藏物的布达佩斯 条约条款并根据这些条款制作了并将维护这种保藏物。
[0010] 含有这种事件的棉花植物的DNA包含本文中描述的连接序列/侧翼序列，所述序 列使棉花基因组内的插入DNA的位置特征化。SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2对于棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3具有诊断性。更具体地说，在SEQ ID N0:1的bp 1354/1355和SEQ ID NO: 2的bp 168/169的连接周围的序列对于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3具有诊断性。以下 段落描述包含这些连接的序列的例子，这些连接是含有棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的棉 花植物的DNA的特征。
[0011] 在另一个实施方案中，本发明提供了在包含棉花DNA的样品中检测棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3的方法，所述方法包括：
[0012] (a)使所述样品与长度至少为10bp的第一引物以及长度至少为10bp的第二引物 接触，所述第一引物与SEQIDNO: 1的bp1-1354内的侧翼序列或其互补物选择性地结合， 所述第二引物与SEQIDNO: 1的bp1355-1672内的插入序列或其互补物选择性地结合；并 且
[0013] (b)测定在所述引物之间产生的扩增子；或者
[0014] (c)使所述样品与长度至少为10bp的第一引物以及长度至少为10bp的第二引物 接触，所述第一引物与SEQIDN0:2的bp1-168内的插入序列或其互补物选择性地结合， 所述第二引物与SEQIDN0:2的bp169-2898内的侧翼序列或其互补物选择性地结合；并 且
[0015] (d)测定在所述引物之间产生的扩增子。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了检测棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的方法，其 包括：
[0017] (a)使所述样品与第一引物以及第二引物接触，所述第一引物与选自下组的侧翼 序列或其互补物结合：SEQIDNO: 1的bp1-1354和SEQIDNO:2的bp169-2898;所述第 二引物与SEQIDNO: 14或其互补物选择性地结合；
[0018] (b)使所述样品经受聚合酶链式反应；并且
[0019] (c)测定在所述引物之间产生的扩增子。
[0020] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的分 离DNA分子。除了SEQIDN0S:1和2之外，这样的分子包括，包含跨SEQIDN0:1的bp1354/1355连接的多核苷酸序列的、长度至少为50bp的分子以及包含跨SEQIDN0:2的 bp168/169连接的多核苷酸序列的、长度至少为50bp的分子。例子为SEQIDNO: 1的bp 1329-1380;SEQIDNO: 1 的bp1304-1405;SEQIDNO: 1 的bp1254-1455;SEQIDNO: 1 的 bp1154-1555;SEQIDN0:1 的bp1054-1655;SEQIDN0:2 的bp143-194;SEQIDN0:2 的bp118-219;SEQIDNO: 2 的bp68-269;以及SEQIDNO: 2 的bp1-369,以及它们的互 补物。
[0021] 另外，本发明的实施方案提供了用于在样品（例如，棉花样品）中检测主题事件的 存在的测定法。所述测定法可基于插入到棉花基因组中的重组构建体的DNA序列、并可基 于在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了在进行这些测定法中有用的试剂盒和条件。
[0022] 本发明的实施方案部分地涉及边界区域DNA序列的克隆和分析，所述边界区域由 来自转基因棉花品系中的PDAB4468的T-DNA的插入产生。这些序列是独特的。基于这些 插入序列和连接序列，可以产生并且产生了事件特异性引物。PCR分析证明，可通过分析用 这些事件特异性引物组产生的PCR扩增子来鉴定这些事件。因而，可以使用这些和其他有 关程序独特地鉴定包含主题披露的所述事件的棉花品系。
[0023] 序列简述
[0024] SEQIDNO: 1为棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的5'DNA侧翼边界序列。核苷酸 1-1354为基因组序列。核苷酸1355-1672为插入序列。
[0025] SEQIDN0:2为棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的3'DNA侧翼边界序列。核苷酸 1-168为插入序列。核苷酸169-2898为基因组序列。
[0026] SEQIDNO: 3为77bp的DNA片段，所述DNA片段对于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的5'整合连接具有诊断性。
[0027] SEQIDN0:4为90bp的DNA片段，所述DNA片段对于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的3'整合连接具有诊断性。
[0028] SEQID勵:5为寡核苷酸引物￡5_1910_5_?，用于丁39?^11(!?)测定法中检测棉花事 件 9582. 814. 19. 1 的 5' 边界。
[0029] SEQID勵:6为寡核苷酸引物已5_1910_5_1?，用于丁&91^311@测定法中检测棉花事 件 9582. 814. 19. 1 的 5' 边界。
[0030] SEQID勵:7为寡核苷酸探针￡5_1910_5?1'，用于丁311/^11^'测定法中检测棉花事 件9582. 814. 19. 1的5'边界。这种探针具有添加到5'端的VIC荧光模块和添加到3'端 的MGB猝灭剂。
[0031] SEQID勵:8为寡核苷酸引物￡5_1910_3_?，用于1^^^11(?测定法中检测棉花事 件 9582. 814. 19. 1 的 3' 边界。
[0032] SEQID勵:9为寡核苷酸引物￡5_1910_3_1?，用于丁391^犯1_?测定法中检测棉花事 件 9582. 814. 19. 1 的 3' 边界。
[0033] SEQIDN0:10为寡核苷酸探针ES_1910_3Pr，用于TaqMan?测定法中检测棉花 事件9582. 814. 19. 1的5'边界。这种探针具有添加到5'端的VIC荧光模块和添加到3' 端的MGB猝灭剂。
[0034] SEQIDNO: 11为寡核苷酸引物IC_Sah7F，用于TaqMan?测定法中检测内源参考 基因Sah7(GenBank:AY117065. 1)。