[0035] SEQID勵：12为寡核苷酸引物1(^&1171?，用于丁39^^11_?测定法中检测内源参考 基因Sah7(GenBank:AY117065. 1)。
[0036] SEQIDNO: 13为寡核苷酸探针IC_Sah7_Pr，用于TaqMan_?测定法中检测内源参 考基因Sah7(GenBank:AY117065. 1)。这种探针具有添加到5'端的Cy5荧光模块和添加到 3'端的BHQ2猝灭剂。
[0037] SEQIDNO: 14 是pDAB4468 的T-链DNA序列。
[0038] 附图简述
[0039] 图1为含有aad-12和pat表达盒的pDAB4468的质粒图谱。
[0040] 图2描绘了棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的TaqMan?测定法的引物和探针位置。
[0041] 用于进行本发明的模式
[0042] 对棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3插入的两端均进行了测序和表征。开发了事件特 异性测定法。同样，已将所述事件映射到棉花基因组上（亚基因组A的3号染色体）。可将 所述事件渗入到另外的良种系中。
[0043] 如在上文背景部分提到的，将转基因导入和整合到植物基因组中涉及一些随机事 件（因此名称"事件"针对所表达的给定插入）。也就是说，利用许多转化技术，诸如农杆菌 转化、生物射弹转化（即，基因枪）、以及碳化硅介导的转化（即，WHISKERS)，转基因将被插 入在基因组中的何处是不可预测的。因而，鉴定在插入物的两侧上的侧翼植物基因组DNA 对于鉴定具有给定插入事件的植物可能是重要的。例如，可以将PCR引物设计为产生跨越 所述插入物与宿主基因组的连接区的PCR扩增子。这种PCR扩增子可以用来鉴定唯一或独 特类型的插入事件。
[0044] 本文中提供的定义和例子有助于描述本发明的实施方案并指导本领域的普通技 术人员实施这些实施方案。除非另外说明，应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法 来理解术语。使用了在37CFR§ 1. 822中提出的DNA碱基的命名法。
[0045] 如本文中使用的，术语"后代"表示包含棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的亲本植物 任何代的后裔。
[0046] 通过用异源DNA(即，包含目的转基因的核酸构建体）转化植物细胞，再生由于将 转基因插入植物的基因组中所产生的植物群体，并选择通过插入到特定基因组位置中而表 征的特定植物而产生转基因"事件"。术语"事件"是指包含所述异源DNA的原始转化体和 /或所述转化体的后代。术语"事件"也指通过转化体与包含基因组DNA/转基因DNA的另 一个品种之间的有性异型杂交所产生的后代。即使在重复回交至轮回亲本之后，来自转化 亲本的插入转基因DNA和侧翼基因组DNA(基因组DNA/转基因DNA)存在于在杂交后代的 相同染色体位置。术语"事件"也指来自包含插入DNA和与插入DNA紧邻的侧翼基因组序 列的原始转化体或其后代的DNA，预期其会转移到因包含所述插入DNA的亲本品系（例如原 始转化体和由自交产生的后代）与不含所述插入DNA的亲本品系的有性杂交而接收了包含 目的转基因的插入DNA的后代中。
[0047] "连接序列"或"边界序列"跨过插入基因组的DNA与来自在插入点侧翼的棉花天 然基因组的DNA连接处的点，植物的遗传物质中的一段或另一段连接序列的鉴定或检测足 以诊断所述事件。包括跨过本文中描述的棉花事件中的插入和相似长度的侧翼DNA的DNA 序列。本文中提供了这种诊断序列的具体例子；然而，与所述插入的连接、或所述插入的连 接和所述基因组重叠的其他序列也具有诊断性，并可依照所述主题披露的本发明实施方案 而使用。
[0048] 本发明实施方案部分地涉及使用这种侧翼序列、连接序列、以及插入序列的事件 鉴定。相关PCR引物和扩增子包括在本发明实施方案中。根据主题发明的实施方案，可以 使用横跨插入DNA和其边界的扩增子的PCR分析方法来检测或鉴定源于主题专有的转基因 棉花品系的商业化转基因棉花品种或品系。
[0049] 侧翼/连接序列对于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3具有诊断性。基于这些序列，产 生了事件特异性引物。PCR分析证明，通过分析用这些事件特异性引物组产生的PCR扩增 子，可将这些棉花品系鉴定为不同的棉花基因型。因而，可以使用这些和其他相关程序独特 地鉴定这些棉花品系。本文中鉴定的这些序列是独特的。
[0050] 本主题发明的实施方案的检测技术联合植物育种对于在包含目的事件的亲本植 物与另一种植物品系杂交（试图在后代中赋予一种或多种另外的目的性状）之后，确定哪 些后代植物包含给定事件是特别有用的。这些PCR分析方法有利于棉花育种计划以及质量 控制，尤其是对于商业化转基因棉花种子而言。现在，也可以制作和使用用于这些转基因棉 花品系的PCR检测试剂盒。这也有利于产品注册和产品监管。
[0051] 此外，可使用侧翼棉花/基因组序列明确地鉴定每一插入物的基因组位置。这种 信息可用来制作针对每一事件特异的分子标记系统。这些系统可用于加速的育种策略，并 用来建立连锁数据。
[0052]更进一步地，所述侧翼序列信息可用来研宄和表征转基因整合过程、基因组整合 位点特征、事件分选、转基因及其侧翼序列的稳定性、以及基因表达（尤其是涉及基因沉 默、转基因甲基化模式、位置效应、以及潜在表达相关元件，诸如MARS[基质附着区]等等）。
[0053]鉴于所有主题披露，应当清楚的是，本主题发明的实施方案包括在[0005]段中鉴 定的以ATCC保藏号可获得的种子。本发明的实施方案还包括在[0005]段中鉴定的从以所 述ATCC保藏号保藏的种子培育的耐除草剂棉花植物。本发明的实施方案还包括所述植物 的部分，诸如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等等（其中植物的这些部分包括 aad-12 和pat、以及SEQIDNOS: 1 和 2)。
[0054] 如本文中使用的，术语"棉花"意指陆地棉（Gossypiumhirsutum)并且包括其可 以与棉花植物培育的所有品种。
[0055] a.本发明实施方案的DNA分子在标记辅助育种（MAB)方法中可用作分子标记。本 发明实施方案的DNA分子可如本领域已知地在鉴定遗传连锁的农艺学上有用的性状的方 法中使用（诸如AFLP标记、RFLP标记、RAH)标记、SNP和SSR)。使用MAB方法可在与本主 题发明的实施方案的棉花植物（或其后代和任何其他棉花栽培种或品种）的杂交的后代中 追踪耐除草剂性状。所述DNA分子为针对这种性状的标记，并且本领域中熟知的MAB方法 可用于在棉花植物中追踪耐除草剂性状，其中至少一种本主题发明的实施方案的棉花品系 或其后代为亲本或祖先。本发明实施方案的所述方法可用于鉴定具有本主题事件的任何棉 花品种。
[0056] 如本文中使用的，"品系"为一组对于至少一种性状在个体间显示很少或没有遗传 变异的植物。可通过几个世代的自花授粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本 的营养繁殖来建立这样的品系。
[0057] 如本文中使用的，术语"栽培种"和"品种"是同义词，并指用于商业生产的品系。
[0058] "稳定性"或"稳定的"意指对于给定组分而言，该组分在世代间保持，且优选地保 持至少三个世代。
[0059] "商业实用性"定义为具有良好的植物活力和高可育性，使得该作物可由农民使用 常规耕作设备而产生，且可使用常规压榨和提取设备从种子提取具有所述组分的油。
[0060] "农艺学上优秀的"意指品系除了由于本主题事件的除草剂耐受性之外，还具有期 望的农艺学特征诸如产率、成熟性、抗病性等等。这些农艺学特征和数据点中的任何和全部 可用于鉴定这类植物，或者作为一系列用于定义这类植物的特征中的一个点或者作为任一 端或两端。
[0061]如本领域技术人员根据本披露认识到的，检测试剂盒的优选实施方案，例如，可含 有针对和/或包含"连接序列"或"过渡序列"（在此棉花基因组侧翼序列与插入序列接触） 的引物和/或探针。例如，这包括设计为用于鉴定一个或两个连接序列（在此插入物与侧翼 序列接触）的多核苷酸探针、引物和/或扩增子。一种常见设计是具有一种在侧翼区中杂 交的引物和一种在插入物中杂交的引物。这样的引物通常每个的长度为约至少约15个残 基。用这样布置，所述引物可用于生成/扩增可检测的扩增子，其指示本主题发明的实施方 案的事件的存在。这些引物可用于生成跨越（并含有）如上所指示的连接序列的扩增子。
[0062] 在侧翼序列中"触地（touchdown) "的引物通常不设计为超过所述连接处超过约 1200个碱基左右而杂交。因此，通常的侧翼引物将设计为包含从插入物开始进入侧翼序列 1200个碱基以内的任一链的至少15个残基。即，包含来自SEQIDNO: 1的碱基对154-1672 和/或SEQIDNO: 2的碱基对1-1369 (或与之杂交）的适当大小的序列的引物落在本主题 发明的实施方案的范围内。同样，插入引物可设计为在插入物上的任何位置，但例如可将 SEQIDNO: 14的残基对1-6387非排他性地用于这种引物设计。
[0063] 本领域技术人员还将认识到可将引物和探针设计为在一定范围的标准杂交和/ 或PCR条件下杂交，其中所述引物或探针并不完全与所例示的序列互补。即，可容许一定程 度的错配或简并。对于大约20个核苷酸的引物，例如，如果错配的碱基在引物的内部或与 扩增子相反的引物末端，通常一个或两个左右的核苷酸并不需要与相反链结合。下面提供 了各种适当的杂交条件。合成的核苷酸类似物，诸如次黄嘌呤核苷，也可在探针中使用。也 可使用肽核酸（PNA)探针、以及DNA和RNA探针。重要的是这样的探针和引物对于本主题 发明的实施方案的事件的存在具有诊断性（能够独特地鉴定和区分）。
[0064]应当指出在PCR扩增中可发生错误，其可能例如导致次要的测序错误。即，除非另 外指出，本文中列出的序列是通过从棉花基因组DNA生成长的扩增子，然后克隆所述扩增 子并将其测序而确定的。考虑到为了从基因组DNA测序而生成充足的扩增子所需要的多轮 扩增，在以此方式生成和确定的序列中发现细微差别和次要偏差并非不寻常。本领域技术 人员应当理解并留意由于这些类型的常见测序错误或偏差所需要的任何调整落在本主题 发明的实施方案的范围内。
[0065]还应当指出，一些基因组序列的缺失并非不常见，例如，当在构建事件过程中插入 序列时。因此，例如也可在本主题的侧翼序列和GENBAN