话，可校正）来自主题棉花事件的异源转基因DNA插入物或侧翼基因 组序列的序列。
[0089] 可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色 是检测DNA扩增子的常用熟知方法。另一种这样的方法是遗传比特分析（GeneticBit Analysis)，其中设计与邻接侧翼基因组DNA序列和插入DNA序列两者重叠的DNA寡核苷 酸。将所述寡核苷酸固定化于微孔板的孔中。在对目的区域的PCR(使用一种在插入序列 中的引物和一种在邻接侧翼基因组序列中的引物）之后，可将单链PCR产物与固定化的寡 核苷酸杂交，并充当模板用于单碱基延伸反应，所述反应使用DNA聚合酶和对预期的下一 个碱基具有特异性的标记的ddNTP。可通过将荧光信号的量进行定量而完成结合产物的分 析。荧光信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的插入/侧翼序列的存在。
[0090]另一种方法是如由Winge(Innov.Pharma.Tech. 00:18-24, 2000)描述的焦磷酸测 序（Pyrosequencing)技术。在这种方法中，设计与邻接基因组DNA和插入DNA连接重叠的 寡核苷酸。设计与来自目的区域的单链PCR产物杂交的寡核苷酸（一种引物在插入序列中， 而一种在侧翼基因组序列中），并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶（sulfurylase)、萤光素酶、 腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase)、腺苷5'磷酰硫酸（adenosine5'phosphosulfate)和萤光 素的存在下孵育。单独添加DNTP，且其掺入导致光信号，对该光信号进行测量。光信号表明 由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在。
[0091] 荧光偏振是另一种可用于检测本发明的实施方案的扩增子的方法。遵循这种方 法，设计与基因组侧翼和插入DNA连接重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交于来自目的区域 的单链PCR产物（一种引物在插入DNA中，一种在侧翼基因组DNA序列中），并在DNA聚合 酶和荧光标记的ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。使用荧光计，可将 荧光标记的ddNTP的掺入测量为在偏振方面的变化。在偏振方面的变化表明由于成功的扩 增、杂交和单碱基延伸所致的转基因插入/侧翼序列的存在。
[0092] TaqMan?(PEAppliedBiosystems，FosterCity，Calif.)是检测和量化DNA 序列的存在的方法。简言之，设计与基因组侧翼和插入DNA连接重叠的FRET寡核苷酸探 针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物（一种引物在插入DNA序 列中，一种在侧翼基因组序列中）。在特异性扩增过程中，TaqDNA聚合酶校对机制使FRET 探针上的荧光模块从淬灭模块释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转 基因插入序列的存在。
[0093] 已描述了分子信标用于多核苷酸序列检测。简言之，设计与侧翼基因组和插入DNA 连接重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和淬灭模块接 近的二级结构。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物（一种引物在 插入DNA序列中，一种在侧翼基因组序列中）。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列 的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭模块的空间分离。其结果为荧光信号。荧 光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
[0094] 已经披露了棉花基因组中对于插入为优良的一个位置，本主题发明的实施方 案还包括在这个基因组位置大致附近（generalvicinity)包含至少一个非棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3插入物的棉花种子和/或棉花植物。一个选项是用不同的插入物取代来 自本文中例示的棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的插入物。一般而言，在特定的实施方案中采 用例如靶向同源重组。这种类型的技术是例如WO03/080809A2及其相应的已公开美国申 请（US20030232410)的主题。因而，本主题发明的实施方案包括植物和植物细胞，其包含 侧翼为本文中鉴定的侧翼序列（SEQIDNO:l的bp1-1354和SEQIDNO:2的bp169-2898) 的全部或可识别部分的异源插入物（代替或与多个拷贝的aad-12或pat基因一起）。也可 以这种/这些方式将aad-12或pat基因的一个或一些另外的拷贝作为插入的靶。
[0095] 包括了下述实施例以说明实践本发明实施方案的程序，并且演示本发明的某些优 选实施方案。这些实施例不应视为限制性的。本领域技术人员应理解下述实施例中披露的 技术代表用于说明其实践的优选模式的具体途径。然而，根据本披露，本领域技术人员应当 理解，可在这些具体实施方案中做出许多变化，仍然获得相似或类似的结果而不背离本发 明的精神和范围。除非另行指明，所有百分比按重量计，所有溶剂混合物比例按体积计，除 非另行指明。
[0096] 除非另行指明，使用下述缩写：
[0097]bp 碱基对
[0098]V 摄氏度
[0099]DNA 脱氧核糖核酸
[0100] EDTA乙二胺四乙酸
[0101] kb 千碱基
[0102] yg 微克
[0103]yL微升
[0104]mL毫升
[0105]M摩尔质量
[0106]PCR聚合酶链式反应
[0107]PTU 植物转录单元或表达盒
[0108] SDS十二烷基硫酸钠
[0109] SSC含有氯化钠和柠檬酸纳的混合物、pH7.0的缓冲溶液
[0110] TBE 含有Tris碱、硼酸和EDTA的混合物、pH8. 3的缓冲溶液 实施例
[0111] 实施例1 :事件特异性TaqMan?测定法
[0112] 开发了事件特异性TaqMan?测定法，以在育种群体中检测棉花事件PDAB4468.19. 10. 3植物的存在。棉花事件pDAB4468.19. 10. 3含有二元载体pDAB4468 的T-链（图1)。为了棉花事件pDAB4468.19. 10. 3的特异性检测，根据位于5'（SEQID N0:1)或3'（SEQIDN0:2)插入物-植物连接中的DNA序列设计了两套TaqMan?引物 和探针（图2)。将用于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的事件特异性测定法之一设计为使用 两种引物和由AppliedBiosystems(ABI)合成、其5'端含有VIC报道子的靶特异性MGB 探针，特异性地检测跨越5'整合连接的77bpDNA片段（SEQIDNO: 3)。将用于棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3的第二事件特异性测定法设计为使用两种特异性引物和由ABI合成、在 其5'端含有VIC报道子的靶特异性MGB探针，特异性地检测跨越3'整合连接的90bpDNA 片段（SEQIDN0:4)。针对其他的AAD12和PAT棉花事件以及非转基因棉花品种（Coker310) 测试了这种用于棉花事件PDAB4468. 19. 10. 3的TaqMan?检测方法的特异性。所有测定 法以双重型式运行，其中TaqMan?测定法设计为检测已知的单拷贝棉花特异性内源参考 基因Sah7(GenBank:AY117065. 1)。
[0113] 实施例1. 1:gDNA分离
[0114]使用改良QiagenDneasy96 植物DNA试剂盒 ?(Qiagen，Valencia，CA)提取基因 组DNA。每个样品使用6个新鲜棉花叶子的子叶盘进行gDNA提取。用PicoGreen?方法， 根据销售商的说明书（MolecularProbes，Eugene，OR)将gDNA定量。将样品以1/5稀释度 用无DNA酶的水进行稀释。
[0115] 实施例1.2:TaqMan?测定法和结果
[0116] 设计特异性TaqMan?引物和探针，用于棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3特 异性TaqMan?测定法。这些试剂与以下列出的条件一起使用，以检测在棉花事件 PDAB4468. 19. 10. 3内的转基因插入物。表1列出了为了检测棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3 的专门开发的引物和探针序列。
[0117] 表1:PCR引物和探针
【主权项】
1. 一种在包含棉花DNA的样品中检测棉花事件pDAB4468. 19. 10. 3的方法，所述方法包 括： (a) 使所述样品与长度至少为IObp的第一引物以及长度至少为IObp的第二引物接触， 所述第一引物与SEQIDNO: 1的bp1-1354内的侧翼序列或其互补物选择性地结合，所述 第二引物与SEQIDNO: 1的bp1355-1672内的插入序列或其互补物选择性地结合；并且测 定在所述引物之间产生的扩增子；或者 (b) 使所述样品与长度至少为IObp的第一引物、以及长度至少为IObp的第二引物接 触，所述第一引物与SEQIDN0:2的bp1-168内的插入序列或其互补物选择性地结合，所 述第二引物与SEQIDN0:2的bp169-2898内的侧翼序列或其互补物选择性地结合；并且 测定在所述引物之间产生的扩增子。
2. 权利要求1的方法，其中所述包含棉花DNA的样品从包含事件pDAB4468. 19. 10. 3、 已经以ATCC登录号PTA-12457保藏的棉花植物获得。
【专利摘要】棉花事件pDAB4468.19.10.3包含具有编码aad 12和pat的基因的基因表达盒，其向含有所述事件的棉花作物提供了除草剂耐受性，并能够实现用于作物保护的方法。本主题发明的实施方案提供了多核苷酸相关事件的检测方法。PTA-1245720120123
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104797716
【申请号】CN201380015711
【发明人】Y·C·崔, R·金, T·M·凯泽, A·E·鲁宾逊, D·佩尔迪, S·G·托莱多, L·B·布拉克斯顿, D·M·安德森
【申请人】陶氏益农公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年1月23日
【公告号】CN104427863A, EP2806732A1, EP2806732A4, US20130189681, US20130212747, WO2013112527A1, WO2013112559A1