1,4-丁二醇的制造方法及微生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种1，4- 丁二醇（butanediol)的制造方法及微生物。
【背景技术】
[0002] 近年，从化石资源的枯渴和地球温暖化的应对等角度来看，以可再生资源为原料 的化合物制造工艺备受瞩目。特别是以生物量（biomass)为原料并采用生物化学工艺来制 造各种聚合物原料化合物和化学品原料化合物的所谓的"生物精练（biorefinery) "更受到 了广泛的关注。
[0003] 作为一种可向生物量进行原料转换的化合物，可列举出1，4-丁二醇。1，4-丁二醇 作为精密有机化学品的合成原料、绦纟仑（polyester)、及工程塑料（engineeringplastic) 的单体（monomer)单位等得到了广泛的应用，其市场规模也非常大。为此，急需一种可采用 以生物量等可再生资源为原料的生物化学工艺来高效制造1，4- 丁二醇的方法。
[0004] 作为采用生物化学工艺来制造1，4- 丁二醇的制造方法，例如，可列举出如下专利 文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法。
[0005][专利文献1]日本专利第4380704号说明书
[0006] [专利文献2]国际公开第2008/115840号公报
[0007][非专利文献l]HarryYimetal.，Metabolicengineeringof Escherichiacolifordirectproductionof1，4-butanediol，NatureChemical Biology，7, 445-452 (2011).
【发明内容】
[0008] [发明要解决的课题]
[0009] 然而，就上述专利文献1、2、及非专利文献1中所记载的方法而言，其工艺较为复 杂。
[0010] 针对上述课题，本发明提供一种可选择性并可经济性地获得1，4-丁二醇的 1，4_ 丁二醇的制造方法。
[0011] [用于解决课题的手段]
[0012] 本发明包括如下：
[0013] [1] 一种1，4-丁二醇的制造方法，其使用微生物及/或其培养物，并利用依次经 由 3-轻丁酰（hydroxybutyryl)CoA、巴豆酰（crotonyl)CoA、及 4-轻丁酰CoA的酵素反应 系（reactionsystem)来制造1,4-丁二醇，所述1,4-丁二醇的制造方法的特征在于，
[0014] 所述 3_ 轻丁酰CoA是光学活性体（opticallyactivesubstance)，
[0015] 所述微生物包括：
[0016] (1)对稀酰（enoyl)CoA水合酶（hydratase)进行编码（code)的遗传基因 (gene)；
[0017] (2)乙稀乙酰（vinylacetyl)CoAA-异构酶（deltaisomerase)进行编码的遗传 基因；
[0018] (3)对4-轻丁酰CoA脱水酶（dehydratase)进行编码的遗传基因；及
[0019] (4)对基质特异性具有与所述3-羟丁酰CoA相反的光学选择性的酰基（acyl)CoA 还原酵素进行编码的遗传基因。
[0020] [2]上述[1]记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，所述微生物还包括：对提供具 有光学活性的3-羟丁酰CoA的乙酰乙酰CoA还原酵素（reductase(还原酶））进行编码的 遗传基因。
[0021] [3]上述[2]记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，所述乙酰乙酰CoA还原酵素 是：乙酰乙酰CoA还原酵素（EC编号：1. 1. 1. 36)、3_轻丁酰CoA脱氢酶（dehydrogenase) (EC编号：1. 1. 1.35)、或 3-羟酰（hydroxyacyl)CoA脱氢酶（EC编号：1. 1. 1. 157)。
[0022] [4]上述[2]记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，对所述乙酰乙酰CoA还原酵素 进行编码的遗传基因是下述（a)~（c)的任一个所记载的遗传基因，即：
[0023] (a)具有序列编号（sequencenumber) 3的盐基序列的遗传基因；
[0024] (b)具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个 盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列 编号3的盐基序列具有90%以上的同一性；及
[0025] (c)在渐快（stringendo)条件下具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互 补盐基序列的遗传基因进行杂交（hybridize)的遗传基因。
[0026] [5]上述[1]记载的1，4-丁二醇的制造方法，其中，对所述酰基CoA还原酵素进行 编码的遗传基因是下述（a)~（c)的任一个所记载的遗传基因，即：
[0027] (a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因；
[0028] (b)具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个 盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列 编号7的盐基序列具有90%以上的同一性；及
[0029] (c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列 的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[0030] [6] -种微生物，其特征在于，包括：
[0031] (1)对烯酰CoA水合酶进行编码的遗传基因；
[0032] (2)对乙烯乙酰CoAA-异构酶进行编码的遗传基因；
[0033] (3)对4-羟丁酰CoA脱水酶进行编码的遗传基因；
[0034] (4)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性为光学选择性的酰基CoA还原酵素进行 编码的遗传基因；及
[0035] (5)对相对于3-羟丁酰CoA的基质特异性具有与所述酰基CoA还原酵素相反的光 学选择性的乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传基因。
[0036] [7]上述[6]记载的微生物，其中，所述乙酰乙酰CoA还原酵素是：乙酰乙酰CoA还 原酵素（EC编号：1. 1. 1. 36)、3-羟丁酰CoA脱氢酶（EC编号：1. 1. 1. 35)、或3-羟酰CoA脱 氢酶（EC编号：1. 1. 1. 157)。
[0037] [8]上述[7]记载的微生物，其中，对所述乙酰乙酰CoA还原酵素进行编码的遗传 基因是下述（a)~（c)的任一个所记载的遗传基因，即：
[0038] (a)具有序列编号3的盐基序列的遗传基因；
[0039] (b)具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号3的盐基序列中1个或多个 盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列 编号3的盐基序列具有90%以上的同一性；及
[0040] (C)在渐快条件下对具有序列编号3的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列 的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[0041] [9]上述[6]记载的微生物，其中，对所述酰基CoA还原酵素进行编码的遗传基因 是下述（a)~（c)的任一个所记载的遗传基因，即：
[0042] (a)具有序列编号7的盐基序列的遗传基因；
[0043] (b)具有盐基序列的遗传基因，该盐基序列是序列编号7的盐基序列中1个或多个 盐基发生了缺失、被进行了置换或被进行了付加的盐基序列，并且，该盐基序列相对于序列 编号7的盐基序列具有90%以上的同一性；及
[0044] (c)在渐快条件下对具有序列编号7的盐基序列的遗传基因和具有互补盐基序列 的遗传基因进行杂交的遗传基因。
[0045] [10]上述[6]记载的微生物，其中，所述微生物是是大肠杆菌、酵母、棒状 (coryneform)细菌、及梭菌属（clostridium)细菌。
[0046] [发明的效果]
[0047] 能够提供一种可选择性并经济性地制造1，4-丁二醇的制造方法。
【附图说明】
[0048] [图1]本实施方式的1，4- 丁二醇的制造方法的酵素系的一例。
【具体实施方式】
[0049] 以下对本发明进行详细说明。这里需要说明的是，在本说明书中，「CoA」是指「辅 酶（coenzyme)A」的意思。另外，如果没有特别的说明，「％」是「质量％」的意思。「ppm」则 是表示质量基准的意思。
[0050] 本实施方式使用微生物，并利用依次经由3-羟丁酰CoA、巴豆酰CoA、及4-羟丁酰 CoA来制造1，4- 丁二醇的酵素反应系。这里，本发明的特征之一是一种可选择性并可高生 产性地制造1，4- 丁二醇的微生物或其培养物的使用方法。
[0051] 本发明人对解决上述课题的技术手段进行了潜心研宄和锐意探索，并发现了一种 可制造1，4- 丁二醇的制造方法，其使用微生物并通过酵素反应系，以3-羟丁酰CoA为基质 (也可为中间