提高棉纤维长度的方法
【专利说明】提高棉纤维长度的方法
[0001] 序列提交
[0002] 本申请是与电子格式的序列表一起提交的。该序列表的名称是 2577215PCTSequenceListing.txt，创建于2012年4月18日，大小为95kb。电子格式的序 列表中信息的全部内容通过援引并入本申请。
[0003] 发明背景
[0004] 本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及棉花WRINKLED1样（WRIL)基因， 其编码的蛋白质作为参与脂肪酸生物合成的基因的转录因子。本发明还涉及提高棉花的棉 纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节参与宿主棉花细胞中脂肪酸生物 合成的酶的活性水平和/或培养宿主棉花细胞。在另一个实施方案中，这些方法涉及操纵 转录因子，所述转录因子可以调节编码参与脂肪酸生物合成的酶的基因。
[0005] 本文中用于说明本发明的背景或者提供额外的关于实施的细节的出版物和其他 材料，通过引用纳入本申请中，并且为方便起见，分别被列于参考文献中。
[0006] 棉花（Gossypiumspp.)是世界上最重要的纤维植物，也是重要的油料种子作物， 在80多个国家种植，世界产量的最高纪录为2006/2007年种植季的1. 22亿包（480镑/ 包）（美国农业部海外农业服务局（UnitedStatesDepartmentofAgriculture-Foreign AgriculturalService))。在1994/1995年，已经发生生产相对于消费的不足，据预计，在 2009/2010生长季该不足将继续扩大至250万包（480镑/包）（美国农业部海外农业服务局 (UnitedStatesDepartmentofAgriculture-ForeignAgriculturalService[USDA-FAS]) 2009)。棉花生产为大约1亿个家庭提供收入，大约有150个国家参与了棉花的进口 和出口。据估计，它的全世界经济影响为大约为每年5千亿美元。此外，在粮食短缺的经济 体系中，改良棉花种子用于食品和饲料能深度提高数百万人民的营养和生计。棉花也是可 再生生物燃料的潜在候选植物。棉纤维几乎是由纯的纤维素组成。相比于木质素，纤维素 能够容易地转变为生物燃料。优化的棉纤维的生产和加工将会确保这种天然可再生产品具 备与石油衍生的合成的非再生纤维竞争的能力，以确保更好的可持续发展。
[0007] 目前，种子总是作物用于人类和动物营养的最重要的部分。主要的种子贮藏化合 物包括例如三酰基甘油（TAG)、蛋白质和碳水化合物，其典型地构成成熟种子的质量的大 部分，并且这些组分的比例有物种特异性的较大变化。由于种子的组成和产率是育种和 农业研宄中的重要性状，碳和氮的分离而进入发育种子中的主要存储产物是重要的过程。 在模式植物拟南芥（Arabidopsis)中，一种含有AP2结构域的转录因子WRINKLED1(WRI1 ; At3g54320)控制蔗糖向三酰基甘油的转化，并在控制碳和氮流入TAG生物合成和积累中显 不较强的作用（CernacandBenning, 2004) 〇
[0008] 由于棉花最重要的农艺性状是纤维质量和产量，提高对于棉纤维发育相关基因的 认识很重要。棉纤维是单细胞的种子毛，棉纤维发育被认为是用于研宄细胞骨架的动力学 和功能的很好的模型系统（Seagull，1990)。探讨细胞骨架的动态变化和细胞骨架相关基因 的表达是如何有助于纤维发育是很重要的。在这个方向已经取得了一些进展。细胞骨架蛋 白GhActin已被证明对纤维伸长而不是纤维起始很重要（Lietal.，2005)。纤维优先的 肌动蛋白结合蛋白（GhPFN2)的过表达过早地阻断细胞伸长（Wangetal.，2010)。另一方 面，据报道，向下调节肌动蛋白解聚因子基因（actindepolymerizingfactor，ADF)增加纤 维长度和纤维强度（(Wangetal.，2009)。
[0009] 棉花的基因功能分析的最终目标是用它们来提高棉纤维的产量和品质。目前，只 有相对很少的基因已经被成功地用于转化棉花并且提高棉纤维的产量和质量。其中不少 来自碳水化合物的生物合成基因。例如，蔗糖合酶基因（SUS和sps)和纤维素合成酶基因 (acsA和acsB)的转基因过度表达改善棉纤维的长度和强度（Ruanetal.，2003;Jianget al.，2011)。类似地，更高的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTH)活性可促进纤维细胞伸 长，并且过表达的xth基因的转基因棉花增加了成熟的纤维长度（Leeetal.，2010)。碳水 化合物生物合成基因的过度表达可将固定碳（fixedcarbon)分配至碳水化合物，从而提高 棉纤维的产量和品质。值得注意的是，发现一些转录因子，其可以调节在棉花生殖器官内的 脂质和碳水化合物之间的碳流。拟南芥的研宄已经表明，在花椰菜花叶病毒（cauliflower mosaicvirus) 35S启动子的控制下过表达拟南芥WRI1cDNA，导致种子含油量增加（Cernac andBenning，2004)。另一方面，剪接突变等位基因wril-1的拟南芥的种子油积累减少。 该突变体中糖酵解降低，使发育的胚不能有效地将蔗糖转换成三酰基甘油的生物合成前体 (CernacandBenning, 2004)〇
[0010] 可用的遗传资源和棉花基因序列将促进棉花主要农艺性状的改良。为此，2007年 发起了确定完整的棉花基因组序列的公共项目。虽然该项目还正在进行，不断增加的棉花 EST序列集（目前约40万条）被存放在公共数据库里。尽管有这么庞大数量的棉花基因序 列可用，只有少数基因的功能已经确定。这主要是因为棉花基因功能的大规模分析一直受 制于产生转基因棉花这个费力又耗时的过程。此外，许多棉花品种难以进行遗传转化。因 此，迫切需要开发以基因组规模进行棉花基因的不依赖于物种的快速功能分析的方法。
[0011] 病毒诱导的基因沉默（virus-inducedgenesilencing,VIGS)提供了有吸引力 的转基因技术的替代，因为它无需植物转化而允许基因功能的研宄（Ruizetal.，1998; Burch-Smithetal.，2004)。候选基因的部分片段被插入到病毒载体内，产生重组病毒。用 该重组病毒感染植物，导致产生病毒相关的小干扰RNA(siRNA) (Baulcombe，2004)，它可介 导相关的内源基因转录物的降解，从而导致被接种植物中候选基因表达的沉默（Brigneti etal.，2004 ;Burch-Smithetal.，2004)。内源性基因表达的沉默效果一般可在病毒接种 1-2周后进行检测。VIGS已成为使用最广泛的、的确很重要的反向遗传学的工具之一，尤其 是对非模式植物而言。
[0012] 人们需要识别参与生物合成途径的基因，其调节可导致棉纤维长度的增加。也需 要开发用于增加棉纤维长度的方法。
【发明内容】
[0013] 本发明涉及植物分子生物学，更具体地涉及棉花WRINKLED1样（WRIL)基因。更具 体地，本发明涉及棉花基因WRIL，其产物作为参与调节脂肪酸生物合成的基因的转录因子。 本发明还涉及提高棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节宿主 棉花细胞中参与脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养该宿主棉花细胞。在另一个实 施方案中，这些方法涉及操纵转录因子，该转录因子可以调节编码参与脂肪酸生物合成的 酶的基因。
[0014] 在第一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码GhWRIL蛋白，其包含如SEQID NO:2所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1所示的核苷酸 序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1的第25-1338位核苷酸所示的核 苷酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQIDNO: 1的第25-1341位核苷酸所 示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子（plantoperable promoter)，其可操作地连接到该核酸。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。 在另一个实施方案中，种子特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
[0015] 在第二方面，本发明提供了分离的核酸，其编码GrWRIL蛋白，其包含如SEQID N0:4所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，该核酸包含如SEQIDN0:3所示的核苷酸序 列。在另一个实施方案中，该核酸包含如SEQIDNO: 3的第32-1345位核苷酸所示的核苷 酸序列。在另一个实施方案中，所述核酸包含如SEQIDN0:3的第32-1348位核苷酸所示 的核苷酸序列。在另外的实施方案中，该核酸还包含可操作地连接到该核酸的植物可操作 启动子。在一个实施方案中，该启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案中，该种子 特异性启动子是棉花种子特异性启动子。
[0016] 在第三方面，本发明提供了构建体或载体，其包含如本文所述的分离的核酸。在一 个实施方案中，该构建体或载体是表达构建体或表达载体。在另一个实施方案中，该构建体 或载体还包含可选择的标记。在另一实施方案中，该构建体或载体包括不含Cre-lox重组 标记的系统。
[0017] 在第四方面，本发明提供了转基因植物，其包含本文描述的核酸或载体。在一个实 施方案中，该转基因植物是棉花植物。
[0018] 在第五方面，本发明提供了用于棉花WRIL基因的下调。在一个实施例中，棉 花WRIL基因的下调涉及使用RNA干扰（RNAi)，其中包括微小RNA(microRNA)和发夹 RNA(hairpinRNA)。在另一个实施方案中，棉花WRIL基因的下调涉及使用病毒诱导的基因 沉默（VIGS)。在一个实施方案中，提供下调GhWRIL基因的核酸。在另一个实施方案中，提 供下调GrWRIL基因的核酸。在一个实施方案中，该核酸还包含植物可操作启动子，其可操 作地连接到该核酸。在一个实施方案中，启动子是种子特异性启动子。在另一个实施方案 中，种子特异性启动子是棉籽启动子。根据该方面，本发明还提供了包含如本文所述的分离 核酸的载体。在一个实施方案中，该载体是表达载体。在另一个实施方案中，该载体还包含 选择标记。在另一个实施方案中，该载体包括不含Cre-lox重组标记的系统。根据该方面， 本发明还提供了转基因植物或感染植物，其包含本文所述的核酸或载体。在一个实施方案 中，该转基因或受感染的植物是棉花植物。
[0019] 在第六方面，本发明提供了增加棉花的棉纤维长