的酶的活性水平进行调节。在一 个实施方案中，该酶是乙酰辅酶A羧化酶（ACCase)。在另一个实施方案中，该酶是酮脂 酰-酰基载体蛋白合酶I(KASI)。在另一个实施方案中，该酶是烯酰基-酰基载体蛋白还原 酶（ENR)。可以通过减少对该酶的表达来降低活性水平。在一个实施方案中，对酶活性进行 调节是将酶活性降低。可以使用本文所述的将酶作为RNA干扰（RNAi)的目标的RNAi技术 来降低酶活性水平。或者，可以使用本文所述的使用目标基因的至少部分片段的VIGS技术 来降低酶活性水平。
[0058] 在另一个实施方案中，方法包括操纵转录因子，该转录因子可以调节参与脂肪酸 生物合成的酶。在一个实施方案中，该转录因子是棉花WRIL蛋白。在另一个实施方案中，棉 花WRIL蛋白是GhWRIL蛋白或GrWRIL蛋白。在一个实施方案中，对转录因子的操纵是减少 表达。在一个实施方案中，可以使用本文所述的将转录因子mRNA作为RNAi的目标的RNAi 技术来减少转录因子表达。或者，可以使用本文所述的使用目标转录因子基因的至少部分 片段的VIGS技术来降低转录因子的活性水平。
[0059] 除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术范围内的化学、分子生物学、微生 物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。参 见例如，Maniatis等人，1982,《分子克隆》（MolecularCloning)(冷泉港实验室出版社， 纽约冷泉港）；Sambrook等人，1989,《分子克隆》（MolecularCloning)，第二版，（冷泉 港实验室出版社，纽约冷泉港）；Sambrook以及Russell，2001，《分子克隆》（Molecular Cloning)，第三版，（冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港）；Ausubel等人，1992,《现代分 子生物学实验技术》（CurrentProtocolsforMolecularBiology)(约翰威立国际出 版公司（JohnWiley&Sons)，包括定期更新）；Glover，1985,《DNA克隆》（DNACloning) (IRL出版社，牛津）；Russell，1984,《植物分子生物学：实验课手册》（Molecularbiology ofplants:alaboratorycoursemanual)(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港）；Anand， 《复杂基因组分析技术》（TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes)(学 术出版社，纽约，1992) ;Guthrie以及Fink，《酵母遗传学和分子生物学指南》（Guide toYeastGeneticsandMolecularBiology)(学术出版社，纽约，1991);Harlow以 及Lane，1988,《抗体》（Antibodies)(冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港）；《核酸杂交》 (NucleicAcidHybridization) (B.D.Hames&S.J.Higgins编著 1984);《转录与翻译》 (TranscriptionAndTranslation) (B.D.Hames&S.J.Higgins编著 1984);《动物细胞培 养》（CultureOfAnimalCells) (R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc. ,1987);《固定化细胞 和酶》（ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRL出版社，1986) ;B.Perbal，《分子克隆实用 指南》（APracticalGuideToMolecularCloning) (1984);著作：《酶学方法》（Methods InEnzymology)(学术出版社，纽约）；《酶学方法》（MethodsInEnzymology)，第154和 155卷，（Wu等人编著），《细胞及分子生物学的免疫化学方法》（ImmunochemicalMethods InCellAndMolecularBiology)(Mayer和Walker编著，学术出版社，伦敦，1987);《实 验免疫学手册》（HandbookOfExperimentalImmunology)，第I-IV卷（D.M.Weir和 C.C.Blackwell编著，1986) ;Riott，《免疫学概论》（EssentialImmunology)，第六版， Blackwell科学出版社，牛津，1988 ;Fire等人，《RNA干扰技术：从基础科学到药物开发》 (RNAInterferenceTechnology:FromBasicSciencetoDrugDevelopment)，剑桥大学 出版社，剑桥，2005 ;Schepers，《RNA干扰实践》(RNAInterferenceinPractice)，Wiley-VCH, 2005 ;Engelke,《RNA干扰（RNAi):siRNA技术要点》（RNAInterference(RNAi):The Nuts&BoltsofsiRNATechnology),DNA出版社，2003 ;Gott,《RNA干扰、编辑及修饰：方法 与实验方案（分子生物学方法）》（RNAInterference,Editing,andModification:Methods andProtocols(MethodsinMolecularBiology))，人类出版社，托托瓦，新泽西州， 2004 ;Sohail，《RNA干扰引起的基因沉默：技术与应用》（GeneSilencingbyRNA Interference:TechnologyandApplication)，CRC，2004。 实施例
[0060] 通过参考以下实施例对本发明进行说明，其通过举例说明的方式提供并且不以任 何方式限制本发明。利用了本领域熟知的标准技术或者下面具体说明的技术。
[0061] 实施例1
[0062] 材料与方法
[0063] 棉花苗：在温室中将棉籽进行增殖和发芽。使用带有2-3片真叶的4-14日龄的种 苗进行VIGS检测。还可以使用只带有子叶的幼苗进行VIGS检测。
[0064] 合成的TRVRNA1表达载体以及合成的TRVRNA2表达载体：参见国际公开号TO 2010/144058。
[0065] 基因克隆及VIGS载体克隆：通过聚合酶连锁反应（PCR)从陆地棉叶样品的cDNA 产物扩增出候选基因，并且将候选基因克隆到合成载体PSTRV2001的Xbal和BamHI的位 点。基因克隆所用的引物在表1中列出，表1还包括对克隆基因的序列的引用。
[0066] 表1、基因引物及基因序列
[0067]
【主权项】
1. 分离的核酸，其编码包含SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白。
2. 权利要求1所述的分离的核酸，其包含SEQIDNO: 1、SEQIDNO: 1的第25-1338位 核苷酸或者SEQIDNO: 1的第25-1341位核苷酸所示的核苷酸序列。
3. 分离的核酸，其编码包含SEQIDN0:4所示的氨基酸序列的蛋白。
4. 权利要求3所述的分离的核酸，其包含SEQIDNO: 3、SEQIDNO: 3的第32-1345位 核苷酸或者SEQIDN0:3的第32-1348位核苷酸所示的核苷酸序列。
5. 权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸，其进一步包含可操作地连接到所述核酸 的植物可操作启动子。
6. 权利要求5所述的分离的核酸，其中所述启动子为种子特异性启动子。
7. 转基因植物细胞、植物或植物种子，其包含稳定地整合入其基因组中的权利要求 1-6中任一项所述的分离的核酸。
8. 权利要求7所述的转基因植物细胞、植物或植物种子，其中所述植物为棉花。
9. 增加棉纤维长度的方法，其包括调节棉花植物中脂肪酸生物合成途径的酶的活性以 增加纤维长度。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述调节是降低所述酶的活性。
11. 权利要求9所述的方法，其中所述酶是乙酰辅酶A羧化酶（ACCase)、0 -酮脂酰-酰 基载体蛋白合酶I(KASI)或烯酰基-酰基载体蛋白还原酶（ENR)。
12. 权利要求10所述的方法，其中所述酶是乙酰辅酶A羧化酶（ACCase)、0-酮脂 酰-酰基载体蛋白合酶I(KASI)或烯酰基-酰基载体蛋白还原酶（ENR)。
13. 权利要求12所述的方法，其中通过RNAi或VIGS介导所述酶活性的降低。
14. 权利要求12所述的方法，其中通过降低转录因子的活性来介导所述酶活性的降 低，所述转录因子调节所述酶的表达。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述转录因子为棉花WRIL。
16. 权利要求15所述的方法，其中通过RNAi或VIGS介导转录因子活性的降低。
17. 权利要求9、10、11、12、14或15中任一项所述的方法，其中在棉花植物的种子中调 节所述酶活性。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述棉花植物是转基因棉花植物。
19. 权利要求18所述的方法，其中通过RNAi介导所述酶活性的降低或所述转录因子活 性的降低。
20. 权利要求9-19中任一项所述的方法，其中与没有调节脂肪酸生物合成路径中的酶 活性的棉花植物相比，纤维长度增加至少4%，优选至少5%，更优选至少6 %，并且最优选 至少7%。
【专利摘要】本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及棉花WRINKLED1样(WREL)基因。更具体地，本发明涉及棉花WRIL基因，其产物作为参与脂肪酸生物合成的基因的转录因子。本发明还涉及提高棉花的棉纤维长度的方法。在一个实施方案中，这些方法包括调节参与宿主棉花细胞脂肪酸生物合成的酶的活性水平和/或培养所述宿主棉花细胞。在另一个实施方案中，这些方法包括操纵可以调节参与脂肪酸生物合成的酶的转录因子。
【IPC分类】C12N15-82, C12N15-29, A01H5-00, C12N15-113
【公开号】CN104797712
【申请号】CN201280074075
【发明人】N-H·蔡, 叶健, 曲景
【申请人】淡马锡生命科学研究院有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2012年4月19日
【公告号】EP2839007A1, US20150074853, WO2013158032A1