抗原特异性辅助性t细胞受体基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及癌抗原特异性辅助性T细胞的T细胞受体（TCR)基因中所包含的多核 苷酸。具体地说，本发明涉及编码对具有SEQIDN0:123所示氨基酸序列的WT1辅助肽有 特异性的⑶4+辅助性T细胞的TCR的各个a链和0链的互补决定区3 (⑶R3)的多核苷 酸。本发明还涉及由这些多核苷酸编码的多肽。此外，本发明涉及含有这些多核苷酸的TCR 基因所导入的CD4+T细胞，使用所述细胞诱导并加强WT1特异性细胞毒性T细胞（WT1特 异性CTL)和使用所述细胞治疗癌症等等。
【背景技术】
[0002] WT1基因（维尔姆斯瘤1基因）是一种被鉴定为造成维尔姆斯瘤的的基因的基团， 维尔姆斯瘤是儿童期肾癌（非专利文件1和2)。WT1是一种具有锌指结构的转录因子。最 初，WT1基因被认为是肿瘤抑制基因。然而，随后的研宄（非专利文件3、4、5和6)表明，WT1 基因倒不如说在血液肿瘤和实体癌中起癌基因的作用。
[0003] 已表明，肽特异性细胞毒性T细胞（CTL)通过使用WT1肽体外刺激外周单核细胞 而被诱导，而这些CTL损害内源性表达WT1的血液肿瘤和实体癌中的肿瘤细胞和癌细胞。因 为CTL识别呈复合体形式（其中WT1肽与MHCI类分子结合）的WT1肽，所以这类WT1肽 因MHCI类亚型而不同（专利文件1、非专利文件7、专利文件2、3和4)。
[0004] 对癌抗原有特异性的辅助性T细胞的存在对有效诱导CTL是重要的（非专利文件 8)。辅助性T细胞通过识别抗原呈递细胞上的MHCII类分子和抗原肽的复合体而被诱导 和激活。激活的辅助性T细胞产生例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等细胞因子或干扰素，并有 助于B细胞的增殖、分化和成熟。激活的辅助性T细胞还具有促进T细胞的其它亚型（例 如Tc细胞）的增殖、分化和成熟的功能。这样一来，由于激活的辅助性T细胞通过促进B 细胞和T细胞的增殖和活化而具有激活免疫系统的功能，因此认为通过MHCII类结合抗原 肽（辅助肽）提高癌疫苗的作用来提高辅助性T细胞的功能可用于癌症免疫疗法（非专利 文件9)。
[0005]目前公认的与WT1有关的辅助肽的实例为与HLA-DRB1 *04:01分子结合的肽 (非专利文件10);与HLA-DRB1*04:05分子结合的肽、与HLA-DRB1*15:02分子结合的肽 (专利文件 5);与HLA-DRB1*04:05 分子、HLA-DRB1*15:02 分子、HLA-DRB1*15:01 分子、 HLA-DPB1*09:01分子和HLA-DPB1*05:01分子结合的肽（专利文件6)。
[0006] 然而，完全不知道识别辅助肽的抗原特异性⑶4+辅助性T细胞的T细胞受体（TCR) 基因的序列。
[0007]
【背景技术】的文件 专利文件 专利文件 1 :W02003/106682 专利文件 2 :W02005/095598 专利文件 3 :W02007/097358 专利文件 4 :PCT/JP2007/074146 专利文件 5 :W02005/045027 专利文件 6 :W02008/105462 非专利文件 非专利文件l:DanielA.Haber等，Cell. 1990Jun29; 61 (7) :1257-69〇
[0008]非专利文件 2 :CallKM等，Cell. 1990Feb9; 60(3) : 509-20。
[0009]非专利文件 3 :MenkeAL等，IntRevCytol. 1998; 181:151-212.综述。
[0010]非专利文件 4 :YamagamiT等，Blood. 1996Apr1; 87(7) : 2878-84。
[0011]非专利文件 5 :InoueK等，Blood. 1998Apr15; 91(8) :2969-76。
[0012] 非专利文件 6 :TsuboiA等，LeukRes. 1999May; 23(5) :499-505〇
[0013]非专利文件 7 :0kaY等，Immunogenetics. 2000Feb; 51 (2) : 99-107。
[0014]非专利文件 8 :GaoFG等，CancerRes. 2002Nov15; 62(22) : 6438-41。
[0015]非专利文件 9 :ZengG,JImmunother. 2001May; 24 (3) : 195-204。
[0016]非专利文件 10:KnightsAJ等，CancerImmunolImmunother. 2002Jul; 51(5):271-81〇
[0017] 发明概述 本发明要解决的问题 本发明要解决的问题是测定对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR基因 的序列，以获得这些TCR基因所导入的⑶4+T细胞，使用所述细胞提高WT1特异性CTL的 诱导，并治疗或预防癌症等。
[0018] 解决问题的方法 本发明人进行了非常努力的研宄以解决上述问题，并成功分离出对WT1辅助肽有特异 性的⑶4+辅助性T细胞的TCR的a链基因和0链基因，并测定了各个⑶R3序列。此外， 本发明人将含有所测定的序列的TCR基因导入⑶4+T细胞中，通过使用这些⑶4+T细胞，成 功提高了WT1特异性CTL的诱导和损害了表达WT1的癌细胞。因此，本发明人完成了本发 明。
[0019] 也就是说，本发明提供： (1) 一种具有选自SEQIDN0: 1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、 30、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、56 和 58 的核苷酸序列的多核苷酸（称为 "a⑶R3多核苷酸")，其中所述多核苷酸编码对WT1辅助肽（WT1332肽）有特异性的⑶4 +辅 助性T细胞的TCR的a链的⑶R3,该肽具有SEQIDN0: 123所示氨基酸序列或其变体序 列。
[0020] (2) -种具有选自SEQIDN0: 2、4、6、7、9、12、15、17、19、21、24、26、29、32、34、 36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57和59的核苷酸序列的多核苷酸（称为" 0CDR3多核 苷酸"），其中所述多核苷酸编码对WT1332肽有特异性的⑶4+辅助性T细胞的TCR的0链 的CDR3〇
[0021](3) -对a⑶R3多核苷酸和0⑶R3多核苷酸，其中每个多核苷酸具有下列核苷 酸序列： a⑶R3多核苷酸 0⑶R3多核苷酸
【主权项】
1. 一种具有选自以下的核苷酸序列的多核苷酸（称为"aCDR3多核苷酸"）：SEQID NO: 1、3、5、8、10、11、13、14、16、18、20、22、23、25、27、28、30、31、33、35、37、39、41、43、45、 47、49、51、53、55、56和58，其中所述多核苷酸编码对訂1辅助肽（1!1 332肽）有特异性的 ⑶4+辅助性T细胞的TCR的a链的⑶R3,所述WTl辅助肽具有SEQIDNO: 123所示氨基 酸序列或其变体序列。
2. -种具有选自以下的核苷酸序列的多核苷酸（称为" 0CDR3多核苷酸"）：SEQID NO: 2、4、6、7、9、12、15、17、19、21、24、26、29、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、57 和59,其中所述多核苷酸编码对WTl332肽有特异性的⑶4 +辅助性T细胞的TCR的0链的 CDR3〇
3. -对a⑶R3多核苷酸和0⑶R3多核苷酸，其中每个多核苷酸具有下列核苷酸序 列： a⑶R3多核苷酸 0⑶R3多核苷酸 SEQ IDNO:ISEQIDNO:2 SEQ IDNO:3 SEQIDNO:4 SEQ IDNO:5 SEQIDNO:6 SEQ IDNO:3 SEQIDNO:7 SEQ IDNO:8 SEQIDNO:9 SEQ IDNO:10 SEQIDNO:12 SEQ IDNO:11 SEQIDNO:12 SEQ IDNO:13 SEQIDNO:15 SEQ IDNO:14 SEQIDNO:15 SEQ IDNO:16 SEQIDNO:17 SEQ IDNO:18 SEQIDNO:19 SEQ IDNO:20 SEQIDNO:21 SEQ IDNO:22 SEQIDNO:24 SEQ IDNO:23 SEQIDNO:24 SEQ IDNO:25 SEQIDNO:26 SEQ IDNO:27 SEQIDNO:4 SEQ IDNO:28 SEQIDNO:29 SEQ IDNO:30 SEQIDNO:32 SEQ IDNO:31 SEQIDNO:32 SEQ IDNO:33 SEQIDNO:34 SEQ IDNO:35 SEQIDNO:36 SEQ IDNO:37 SEQIDNO:38 SEQ IDNO:39 SEQIDNO:40 SEQ IDNO:41 SEQIDNO:42 SEQ IDNO:43 SEQIDNO:44 SEQ IDNO:45 SEQIDNO:46 SEQ IDNO:47 SEQIDNO:48 SEQIDNO:49 SEQIDNO:50 SEQIDNO:51 SEQIDNO:52 SEQ IDNO:53 SEQIDNO :54 SEQ IDNO:55 SEQIDNO :57 SEQ IDNO:56 SEQIDNO :57 SEQ IDNO:58 SEQIDNO :59 条件是所述序列可以是其互补序列或简并序列。
4. 一种TCR基因，其包含权利要求3中任一对的a⑶R3多核苷酸和0⑶R3多核苷酸。
5. 权利要求4的TCR基因，其可获自对WTl332肽有特异性的⑶4 +T细胞。
6. -种用于产生对WTl332肽有特异性的CD4+辅助细胞的方法，所述方法包括将权利要 求4或5的TCR基因导入⑶4+T细胞中。
7. -种通过权利要求6的方法可获得的⑶4+辅助性T细胞。
8. -种包含TCR基因的载体，所述TCR基因包含权利要求3中任一对的aOTR3多核 苷酸和0⑶R3多核苷酸。
9. 权利要求6的方法，其中所述导入使用权利要求8的载体进行。
10. -种用于提高WTl特异性CTL的诱导的方法，所述方法包括将权利要求7的⑶4+ 辅助性T细胞和外周单核细胞共培养。
11. 一种通过权利要求10的方法可获得的WTl特异性CTL。
12. -种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括将权利要求7的CD4+辅 助性T细胞导入受试者中。
13. -种用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含权利要求7的CD4+辅助性T细胞。
14. 权利要求7的CD4+辅助性T细胞在用于制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
15. -种DNA芯片，其包含权利要求1的a⑶R3多核苷酸、权利要求2的0⑶R3多核 苷酸或权利要求1的a⑶R3多核苷酸和权利要求2的13⑶R3多核苷酸两者。
16. -种测量样品中对WTl332肽有特异性的CD4 +辅助性T细胞的频率的方法，所述方 法包括使用权利要求15的DNA芯片。
17. -种a⑶R3肽，其由权利要求1的任一个a⑶R3多核苷酸编码。
18. -种0⑶R3肽，其由权利要求2的任一个0⑶R3多核苷酸编码。
19. 一种由权利要求3的任一对的多核苷酸编码的肽对。
20. -种芯片，其包含权利要求17或18的肽或权利要求19的肽对。
21. -种针对权利要求17-19中任一项的任一肽的抗体。
22. -种测量样品中对WTl332肽有特异性的CD4 +辅助性T细胞的频率的方法，所述方 法包括使用权利要求21的抗体。
【专利摘要】本发明涉及编码对WT1辅助肽有特异性的CD4+辅助性T细胞的TCR-α链和TCR-β链基因中的CDR3的多核苷酸，所述WT1辅助肽具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列。本发明还涉及由所述多核苷酸编码的肽。本发明还涉及已导入含有所述多核苷酸的TCR基因的CD4+ T细胞、使用CD4+ T细胞诱导WT1特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)、癌症的治疗等。
【IPC分类】G01N33-569, C07K16-28, C12N5-10, C12Q1-68, C12N5-0783, C12N15-85, C07K14-725, A61K35-17, A61P35-00, C12N15-12
【公开号】CN104797711
【申请号】CN201380058833
【发明人】杉山治夫, 藤木文博
【申请人】株式会社癌免疫研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年9月12日
【公告号】CA2884366A1, EP2896693A1, WO2014042226A1