被量的确定
[0040]为得到最适的抗体-胶体金标记物在金标垫上的包被量，取1.3中离心后复溶得到的抗体-胶体金标记溶液，分别按照1:1、1:2、1:3、1:4、1:5稀释，处理金标垫，制成试纸条后用0.01mol/L pH 7.4的PBS滴定，观察检测线(T线)显色强度，选择显色能达到肉眼观察要求的最大稀释比例为最佳包被量。T线显色强度从原液到1:5递减，1:5的显色呈弱粉色，则选择1:4为抗体-胶体金标记物的最佳包被量，即取20ul的抗体-胶体金标记物溶液，添加80ul的复溶液，吹吸混勾得到的lOOul溶液对金标垫进行处理。
[0041]1.6金标垫的制备
[0042]将金标垫浸泡于PBS(pH 8.0，含0.5% Tween 20)中，均匀浸湿后45°C烘干2h备用。取处理后的金标垫浸泡于制备好的抗体-胶体金标记物溶液中，每6cm结合物金标垫浸于lOOul抗体-胶体金标记物溶液，于37°C烘干lh，置于干燥环境备用。
[0043]2.样品垫的制备
[0044]2.1样品垫处理液的选择
[0045]分别对样品垫处理液的离子强度(20、50、100mM)，ΡΗ(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，BSA含量(1%、2%、3% )，表面活性剂(Tween 20、PVP、PEG 2000)及含量(0.5%、1 %、2% )，海藻糖含量(5%、10%、15% )进行优化，通过T线显色情况确定选用50mM的硼酸缓冲液(PH8.0,1% BSA.0.5% Tween 20，2% PVP、5%海藻糖)为样品垫的处理液。
[0046]2.2样品垫的处理方式
[0047]将样品垫浸泡于50mM 硼酸缓冲液(PH 8.0，含 1 % BSA，0.5% Tween 20,2% PVP，5%海藻糖)中，均匀浸湿后45°C烘干2h备用。
[0048]3.NC膜(反应膜)的制备
[0049]3.1T线工作浓度范围的确定
[0050]将包被抗原ZEN-BSA用稀释液稀释成0.5、l、2、4、8mg/mL共7个浓度，按常规喷量1.0 μ L/cm包被到NC膜上作为T线，同时将羊抗鼠IgG稀释成lmg/mL按常规喷量1.0 μ L/cm包被到NC膜上作为控制线(C线)，60°C干燥箱放置lh待稳定；上述NC膜与金标垫组装成试纸条，用0.0lmol/L pH 7.4的PBS滴定，观察T线显色强度，选择显色能达到肉眼观察要求的最小用量2mg/mL为最佳标记量。
[0051]3.2C线工作浓度范围的确定
[0052]根据T线工作浓度范围，将羊抗鼠IgG设置浓度为lmg/mL，按喷量0.2,0.4,0.6、
0.8、1 μ L/cm包被到NC膜上作为C线，与金标结合垫组装后，用PBS液滴定，选择C线显色深度适中、比T线略浅的浓度0.8 μ L/cm作为C线的喷量。
[0053]3.3T线、C线以及金标抗体包被量配比的调试
[0054]在T线、C线工作浓度范围内，选择一组质量浓度按常规喷量包被到NC膜上，与金标垫组装后，37°C干燥箱放置24h，用PBS液和玉米赤霉烯酮标准溶液滴定，根据显色情况，再细调C、T线包被浓度配比。
[0055]T线、C线包被浓度配比选择标准:a.阴性溶液(PBS液)滴定时，C线和T线显色深度适中，T线显色大于等于C线。b.玉米赤霉烯酮标准品液滴定时，试剂板灵敏度越高越好。
[0056]3.4NC膜的制备
[0057]将玉米赤霉稀酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物以2mg/mL、l.0 μ L/cm的条件包被到NC膜上构成T线，将羊抗鼠IgG以lmg/mL、0.8 μ L/cm的条件包被在NC膜上构成C线。
[0058]4试剂条的组装
[0059]将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次粘在PVC底板上，用切割机将组装好的大卡割成4mm宽的试纸条。所述的样品垫长18?20mm，宽4?5mm ;结合垫长5?7mm，宽4?5mm ;NC膜反应膜为Millipore 315，检测线与质控线之间的距离为4?7mm，；吸水垫长18?20_，宽4?5_ ;所述吸水垫4与反应膜3交叠3.1-3.7mm ;所述胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.lmm-3.5mm ;所述样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.lmm-3.5mm。。试纸条组成结构如图1所示。
[0060]5样品前处理方法的选择
[0061]5.1提取液的选择
[0062]对常用的甲醇、乙腈、乙酸乙酯及1:1的甲醇和乙腈混合溶液的提取能力进行对比，发现乙腈沉淀蛋白能力，对玉米赤霉烯酮回收效果最优。
[0063]5.2脱脂方式的选择
[0064]乳及乳品中含有大量蛋白和脂肪，乙腈可除去大部分蛋白和少量脂类物质，但提取液中仍有脂肪干扰玉米赤霉稀酮的提取。对提取液用沉淀离心(5000r/min，5min)的方法脱脂。
[0065]5.3对样品的前处理
[0066]在样品中加入等体积的乙腈，将提取液进行离心(5000r/min，5min)处理，吸取上清液用于检测。
[0067]6检测方法
[0068]取100 μ L ZEN标准溶液或样品提取液滴到样品垫上，液体会从样品垫经结合垫、NC膜最终被吸水垫吸收。8?15min后观察检测结果。检测线31 (T线)出现红色条带，样品呈阴性，检测线31 (T线)没出现红色条带，样品呈阳性。如果控制线32 (C线)无条带，说明试纸条无效。
[0069]7试纸条的灵敏度和检测范围
[0070]取空白奶样，在其中分别添加玉米赤霉烯酮至终浓度为20、50、80、100、200ng/mL。
用试纸条检测，每个浓度重复3次。
[0071]用试纸条检测样本时，当其中玉米赤霉稀酮添加浓度为30ng/ml时，试纸条C线显色，T线不显色，玉米赤霉烯酮添加浓度低于30ng/ml时，试纸条显示出两条红色，呈弱阴性，表明本试纸条对乳中玉米赤霉烯酮的检测灵敏度即最低检测限为30ng/ml ;当玉米赤霉烯酮添加浓度为200ng/ml时，试纸条C线显色，T线不显色，呈阳性，当玉米赤霉烯酮添加浓度大于200ng/ml时，试纸条C线显色，T线也显色，呈弱阳性，表明本试纸条对乳中玉米赤霉烯酮的最高检测限为200ng/ml。综上可知，本发明提供的试纸条对玉米赤霉烯酮的检测范围为30ng/ml?200ng/ml，检测限可低达30ng/ml。
[0072]8试纸条的稳定性
[0073]将试纸条密封分别存放于37、25和4°C，观察不同温度对试纸条的影响。每天取出37°C保存的试纸条分别检测0、50、100ng/mLZEN标品溶液；每3d取出25°C保存的试纸条分别检测0、50、100ng/mL的ZEN标品溶液；每周取出4°C保存的试纸条分别检测0、50、lOOng/mL的ZEN标品溶液，通过检测结果判断试纸条的保质期。
[0074]试纸条分别在4°C和25°C下密封保存3个月，灵敏度未发生改变；37°C密封保存的试纸条15d内灵敏度保持不变，表明本试纸条稳定性较好。
[0075]9试剂条的特异性
[0076]通过与结构类似物及其他霉菌毒素的交叉反应试验来研究试剂条的特异性，选用黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素为交叉反应物，试纸条C线和T线均显色，呈阴性。说明本试纸条对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素无交叉反应。
[0077]实施例2
[0078]按照实施例1中的方法制备一种检测牛乳中玉米赤霉烯酮的试纸条，该试纸条包括样品垫1，胶体金结合垫2，反应膜3，吸水垫4和底板5，其特征在于，反应膜3位于底板5中间，反应膜的一侧从上至下依次设有交叠连接的样品垫1和胶体金结合垫2，另一侧设有吸水垫4 ;胶体金结合垫2和吸水垫4均与反应膜3交叠连接；反应膜3上设有检测线31和控制线32 ;检测线31上包被有玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物；控制线32上包被有羊抗鼠IgG ;玉米赤霉烯酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物在检测线31上的包被量为2ug ;羊抗鼠IgG在控制线32上的包被量为0.8ugo反应膜3，为硝酸纤维素膜。
[0079]样品垫1长18_，宽4mm ;胶体金结合垫2长5_，宽4mm ;吸水垫4长18_，宽4mm。
[0080]检测线31和控制线32间距4mm。
[0081]吸水垫4与反应膜3交叠3.1mm ;胶体金结合垫2和反应膜3交叠3.1mm ;样品垫1和胶体金结合垫2交叠3.1_。
[0082]玉米赤霉稀酮半抗原-牛血清白蛋白偶联物，喷涂浓度为2mg/mL、喷量为l.0yL/cm ;所述羊抗鼠IgG，喷涂浓度为lmg/mL、喷量为0.8 μ L/cm。
[0083]胶体金结合垫2的制备方法如下:
[0084]1)抗体-胶体金标记物溶液的制备??每lmL胶体金溶液，加入1 μ L 0.lmol/L1(20)3和3 μ L0.9mg/mL抗玉米赤霉烯酮单抗，混匀后避光静置15min ;然后加入100 μ L10%BSA溶液，混匀后避光静置15min ;于4°C、lOOOOr/min下离心15min，将弃去上清液后所得的沉淀用100 μ L20mM复溶液溶解，获得抗体-胶体金标记物溶液，4°C保存备用；复溶液为包含1% BSA、0.5% Tween20和5%海藻糖，且pH值为8.0的硼酸缓冲溶液；
[0085]2)将浸泡于PBS溶液(pH 8.0，含0.5 % Tween 20)中，均匀浸湿后45°C烘干2h备用，获得预处理金标垫；
[0086]3)将步骤1)所制备的抗体-胶体金标记物溶液用步骤1)所述复溶液按照体积比为1:4进行稀释，获得抗体-胶体金标记物溶液的稀释液；
[0087]4)取步骤2)所得预处理金标垫浸泡于步骤3)所制备的抗体-胶体金标记物溶液的稀释液中，每6cm预处理金标垫浸于100 μ L抗体-胶体金标记物溶液的