高产洛伐他汀的棒曲霉（Aspergillus clavatus）Ac-32菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术微生物领域，尤其涉及I株液体发酵生产Lovastatin的棒曲霉XAspergillus clavatus) Ac-32菌株、用途和发酵生产方法。
【背景技术】
[0002]近年来，我国人群的心血管病患病率、发病率及其危险因素水平不断上升，最新全国疾病监测系统的数据显示，我国心血管病占总死亡的比例从37.5%上升至40.7%。曲霉的次级代谢产物洛伐他汀(Lovastatin)，因在高血脂、动脉粥样硬化及心脑血管疾病的防治中作用机理明确、临床疗效显著，已成为治疗心血管疾病的最畅销药品之一。
[0003]1979年，日本学者远滕章(Akira Endo)等从红色红曲霉(iftwasciA? ri/Aer)发酵液中分离得到一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质，命名为莫纳可林K (Monacolin K)。1980年，Alberts等从土曲霉terreus)中提取到相同的化合物，现命名为Lovastatin (洛伐他汀)。1982年，Paulus等研究了 Lovastatin及其类似物在家兔体内的降胆固醇活性。1987年，美国Merck公司经FDA批准，率先推出人类历史上第一个羟甲基戊二酞辅酶A还原酶抑制剂Lovastatin，被认为是降血脂药物研究进展的一个里程碑。自此，微生物发酵生产Lovastatin的研究取得了长足的进步。
[0004]国内从20世纪90年代初期开始对Lovastatin类物质进行研究，但Lovastatin类药物是一类重要的聚酮类化合物，因具有复杂的结构而难以通过合成的方法来进行大规模生产，而美国和日本等国家己通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和发酵工艺。因此，选育出稳定高产Lovastatin的菌种显得非常的迫切，也是Lovastatin工业化生产的基本保障。
[0005]曲霉属真菌广泛分布于食品、土壤、空气和各种有机质中，主要以枯死的植物、动物的排泻物及动物尸体为营养源。不同种类的曲霉生活习性差异较大，大多数曲霉属于中温性，少数为高温性。多数为好氧性，对水分的要求为中生性，孢子萌发的最低相对湿度一般在85%以下，其中一些干生性曲霉在相对湿度为65%左右时萌发。曲霉属真菌能够产生葡萄糖氧化酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等多种具有催化作用的酶；柠檬酸、葡萄糖酸等在工业和制药上起着重要作用的有机酸；此外还会产生具有重要应用价值的生理活性物质Lovastatin。
[0006]曲霉在食品药品生产中获得了长期的实践证明，曲霉多数种都是较安全的，在市售的药品中，Lovastatin于20世纪90年代直接开发为治疗高血压的药物，其生产和应用均不存在安全隐患，能直接应用于食品药品。
【发明内容】
[0007]针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供I株高产Lovastatin棒曲霉clavatus)kc~?,2菌株和发酵生产Lovastatin的方法。
[0008]本发明所述棒曲霉cJaKaii/6.) Ac_32菌株，保藏编号为:CCTCC M2015504，保藏地为:中国典型培养物保藏中心，保藏地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏日期为:2015年9月I日。该棒曲霉(clavatus) Ac_32菌株可用于发酵生产Lovastatin0
[0009]本发明所涉及的Ac-32曲霉菌株筛选自自然发酵的面包，经初筛、复筛和培养条件优化后获得，5 L发酵罐发酵110 h -140 h，其Lovastatin产量可达200 mg/L~ 250 mg/L左右。经形态特征、生理生化特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为棒曲霉(
cla va tus )。
[0010]该棒曲霉Ac-32菌株用于生产洛伐他汀的方法，该方法包括以下的步骤:
1)用接种针挑少量棒曲霉Ac-32菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d ;取平皿中I菌饼接种于H)培养液中，摇床培养2~4 d，制得一级种子；
2)在种子培养液中，按种子培养液质量的3~8%加入一级种子，100-300r/min摇床培养l~3d成二级种子；
3)在发酵罐中按发酵物质量的10~20%接入二级种子进行发酵培养。
[0011]作为优选，所述的发酵培养的温度范围为25°C -35°C, pH范围为3.5-6.5。
[0012]作为优选，所述的发酵物的有机碳源选用可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、麦芽糖、番薯粉和甘油中的一种或多种混合。
[0013]作为优选，所述的发酵物的氮源选用无机氮源和有机氮源中的一种或多种混合。作为再优选，无机氮源选用硝酸钠、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的一种或多种混合；有机氮源选用牛肉膏、干酪素、酵母粉、蛋白胨和尿素中的一种或多种混合。
[0014]本发明所筛选的棒曲霉{Aspergillus cla va tus) Ac_32菌株，具有高产Lovastatin，生长速度快、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.2，培养温度为28°C条件下，Ac-32菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5 L发酵罐发酵110 h -140 h，Lovastatin 产量可达 200 mg/L~ 250 mg/L 左右。
【附图说明】
[0015]图1 Ac-32曲霉菌株PDA培养基上培养5 d菌落正面(左)和背面(右)。
[0016]图2 Ac-32曲霉菌株PDA培养基上培养3 d分生孢子头生长的显微特征(100 X)。
[0017]图3 Ac-32曲霉菌株分生孢子头显微特征(呈棒状，左200 X，左400 X)。
[0018]图4 Ac-32曲霉菌株分生孢子显微特征(400 X)。
[0019]图5 Ac-32 曲霉菌株 18S rDNA 基因序列(1329 bp)。
[0020]图6基于18S rDNA基因序列建立的曲霉属(Aspergillus)系统发育树。
[0021]图7 Ac-32菌株在5 L发酵罐中菌丝生长曲线。
[0022]图8 Ac-32菌株在5 L发酵罐中Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0023]下面对本发明【具体实施方式】做一个详细的说明。
[0024]实施例1棒曲霉(cJaKaii/6.) Ac-32菌株的分离、筛选和鉴定 I培养基
①PDA培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，水I L，pH 5.5-6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
[0025]②H)培养基:马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水I L，pH 5.5-6.0。用于高产Lovastatin曲霉菌株的筛选。
[0026]2实验方法
2.1曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，28°C培养24 h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一 PDA培养基平板上继续培养3 d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4 °C冰箱备用。
[0027]2.2高产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法(HPLC)检测曲霉菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株28°C PDA平板培养3 d后，用打孔器取I菌饼(直径0.8 mm)转接种于H)培养液中，28°C、200 r/min摇床培养5 d。取发酵液I mL，加甲醇4mL (按1:4的比例)，超声处理20 min，50°C水浴2 h, 3000 r/min离心3 min，取上清液，经0.45 μ m滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。
[0028]2.3 Ac-32曲霉菌株的鉴定
用镊子挑取少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，活化培养3 d ;取平皿中I菌饼(直径0.8 mm)接种于新的PDA培养基平板上，28°C，培养3 d，显微镜观察Ac_32菌株的