[0039] 1. 2试剂盒的制备；
[0040] 反应缓冲液，按照W下配方配制；lOmMdNTP、10X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜 菜碱、50mMM拆〇4;
[0041]引物；外引物F3,其核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示；外引物B3,其核巧酸序列如 869 10^:2所示；内引物尸化其核巧酸序列如569 10^:3所示，内引物8化其核巧酸 序列如SEQIDN0:4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/yl，内引物FIP和 内引物BIP的浓度为40pmol/y1。
[004引2U的AMV逆转录酶；
[0043]SU的BstDNA聚合酶；
[0044]核酸染料aOOOXSYBRGreenI;
[004引阳性对照：郁金香碎色病毒基因组DM;
[0046]阴性对照；lOOmMTris-HCl(pH8. 0)和 50mM邸TA。
[0047] 实施例2郁金香碎色病毒特异性检测
[0048] 2. 1RT-LAMP特异性检测
[0049] 待测样品包括从郁金香栽培基地获得的5株郁金香碎色病毒W及甜菜花叶病毒、 洋葱黄矮病毒和烟草蚀纹病毒各1株。
[0050] 使用实施例1制备的试剂盒按照W下步骤对郁金香碎色病毒进行检测：
[0051] (1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA;
[005引 似建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25yl反应体系，其中四种引物各lyl、 反应缓冲液2. 5y1、2UAMV逆转录酶1y1、8UBstDM聚合酶1y1、步骤（1)所得模板DNA2yl，加水补充至25yl，并W郁金香碎色病毒基因组DM作为阳性对照，WlOOmM Tris-肥1p服.0和50mM邸TA作为阴性对照；
[005引（3)LAMP反应；将步骤（2)中PCR管于63°C恒温反应60min;
[0054] (4)分析判断反应产物结果：在（3)中所得反应产物中加入liUlOOOXSYBR GreenI，如反应液颜色为澄色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。 [00巧]2. 2检测结果
[0056] 5株郁金香碎色病毒的PCR管中均呈现绿色，而甜菜花叶病毒、洋葱黄矮病毒和烟 草蚀纹病毒的显色结果均为澄色，表明引物具有很强的特异性。
[0057] 实施例3郁金香碎色病毒灵敏度检测
[0058] 3. 1RT-LAMP灵敏度检测
[0059] 按照实施例2的步骤（1)提取郁金香碎色病毒RNA，并W10倍浓度系列稀释法稀 释成lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg共 7 个梯度。
[0060] RT-LAMP反应体系和反应条件w及结果分析同实施例2的步骤（2)-(4)。
[0061] 3.2检测结果
[0062] 除了DNA浓度为lOOfg的PCR管显示澄色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色， 表明本发明的检测方法的最低检测极限达到IpgDM,灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、 Bst DNA聚合酶和核酸染料。2. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述引物的核苷 酸序列如下所示： 外引物 F3:TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQ ID N0:1) 外引物 B3 :CTTCGTAGITCGTGAGTCA (SEQ ID NO:2) 内引物 FIP :CATCCCCAITGACAAAGTAACGG-TACACATGTTAAATCTGGAGTGT(SEQ ID N0:3) 内引物 BIP:ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCCAACTGCTCG(SEQ ID N0:4)。3. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述反应缓冲液 由IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgSO4组成。4. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述核酸染料为 SYBR Green 1〇5. 根据权利要求1-3任一项所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其进一步包 括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。6. -种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括以下步骤： (1) 利用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取待测样品 RNA ; (2) 设计并合成引物； (3) 在PCR管中制备25yl的RT-LAMP反应体系，其包括5pmol/yl的外引物F31yl、 5pmol/ y 1 的外引物 B31 y l、40pmol/ y 1 的内引物 FIPl y l、40pmol/ y 1 的内引物 BIP lyl、反应缓冲液2?5yl、2UAMV逆转录酶lyl、8UBstDNA聚合酶lyl、模板DNA2yl， 加水补充至25 yl，并以郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，以IOOmM Tris-HCl pH8. 0和50mM EDTA作为阴性对照； ⑷LAMP反应：将步骤⑶中PCR管于63°C恒温反应60min ; (5)分析判断反应产物结果：在（4)中所得反应产物中加入I y 1核酸染料，如反应液 颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。7. 根据权利要求6所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，所述引物的核苷酸序列 如下所示： 外引物 F3:TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQ ID N0:1) 外引物 B3 :CTTCGTAGITCGTGAGTCA (SEQ ID NO:2) 内引物 FIP :CATCCCCAITGACAAAGTAACGG-TACACATGTTAAATCTGGAGTGT(SEQ ID N0:3) 内引物 BIP:ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCCAACTGCTCG(SEQ ID N0:4)。8. 根据权利要求6所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其中所述反应缓冲液由 IOmM dNTP、10XThermoPol 反应缓冲液、5mM 甜菜碱和 50mM MgSO4组成。9. 根据权利要求6所述的郁金香碎色病毒LAMP检测方法，其中所述核酸染料为SYBR Green 1〇
【专利摘要】本发明涉及一种郁金香碎色病毒(Tulipa breaking virus,TuBV)RT-LAMP检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。本发明还涉及郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒能够对郁金香碎色病毒进行快速、高效、简便的分子生物学检测。
【IPC分类】C12R1/94, C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN104988244
【申请号】CN201510435866
【发明人】孔涛
【申请人】孔涛
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月22日