荧光定量rt-pcr实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒或噬菌体的测定或检验方法技术领域，尤其涉及一种精确、特异快速区分动物重大疫病的方法，具体说是一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法。
【背景技术】
[0002]猪瘟(Classicalswine fever，CSF)或(Hog cholera，HC)是一种严重危害猪的烈性病毒性传染病。由于CSF对养猪业危害巨大，且难以有效控制，世界动物卫生组织(OIE)曾经将其列为A类动物疫病，在2008版的《陆生动物法典》1.2.3.5中将其列为必须报告的7种猪的重要传染病之一。2008年我国农业部公告1125号《一、二、三类动物疫病病种名录》中也将其列为17种一类动物传染病之一。世界各国对CSF都采取严格的防控措施，将其控制或扑灭。OIE的最新资料显示，目前在中美洲、南美洲、欧洲、亚洲和非洲部分地区都有CSF的发生，北美、澳大利亚和新西兰已经消灭了 CSF。但从20世纪90年代开始，CSF又在部分国家和地区出现暴发和流行，如新西兰(1997)、德国(1993-2001)、比利时(1990，1993，1994)、意大利(1995，1996，1997)、英国(2000)、罗马尼亚(2000)、斯洛伐克(2000)、西班牙(2000)、新加坡(2007) ο保加利亚在2009年8月发生过CSF，2008-2010年I月俄罗斯、2009年墨西哥、2009年巴西、2010年瓜地马拉等国家和地区都有CSF发生病例的报告，可见CSF依然是目前猪群中重要的疫病。虽然各国都对其采取了严厉的措施，但不时仍有新病例的出现乃至疫病的暴发。对猪瘟的根除还需要下很大的气力，在本病的研宄上也还有许多未知的方面，需要进一步的深入研宄。
[0003]对于猪瘟病毒野毒株和疫苗毒株的检测，通常可采用病毒分离鉴定技术，但该方法病毒分离鉴定耗时长，难以推广普及应用，难以应用于养殖场猪瘟病毒鉴定和疫病控制。为提高毒株检测的效率与准确度，曾设计出RT-PCR(Reverse Transcript1n-PCR)来检测组织样品中的病毒，该方法是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。虽然，RT-PCR具有很高的特异性和重复性，但无法实现定量检测。为解决定量检测的问题，曾采用荧光定量RT-PCR技术，以进一步提高检测的准确性。
[0004]如申请公布号为CN102808040A的发明专利公开了 “一种实时荧光定量RT-PCR鉴别猪瘟强毒与疫苗弱毒的方法”，该方法设计合成了 3条引物，Pl (5丨-TTGGCATCATTGCATAAGGG-3丨)为猪瘟强毒特异上游引物，P2(5r -GTGGTCTACACAGGGGGGGT-3r )为猪瘟兔化弱毒疫苗株特异上游引物，P3 C -GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3')为猪瘟病毒共用下游引物，P1/P3可特异性扩增猪瘟病毒强毒株，预期扩增产物为549bp，Tm值为89.5±0.5°C；P2/P3可特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗株，预期扩增产物为164bp，Tm值为84.5±0.5°C。在最优条件下进行荧光定量RT-PCR反应和复合荧光定量RT-PCR反应。为实现相近似的发明目的，本发明提供了另一种检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，为猪瘟疫病控制及净化提供了可靠技术保障。
[0006]本发明提供了如下技术方案:该荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其技术要点是，包括以下步骤:
[0007]I)设计特异性引物3-UTR，其序列为:
[0008]3-UTR For:5，-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3，；
[0009]3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’ ；
[0010]2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA ;
[0011 ] 3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA ；
[0012]4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μΜο1/1，PCR反应条件为:950C预变性30s, 950C变性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s，共40循环。
[0013]本发明另提供了一种实时荧光定量RT-PCR鉴别检测猪瘟野毒强毒株的特异性引物，其技术要点是:所述特异性引物的序列为:
[0014]3-UTR For:5，-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3，；
[0015]3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’。
[0016]在QuantStud1? 6Flex实时荧光定量PCR系统基础上建立了快速、灵敏、特异区分检测CSFV强毒株和疫苗毒株的SYBRgreen荧光定量PCR方法。经过对本发明所建立的方法进行特异性、灵敏度的验证，结果显示本方法可以区分检测猪瘟病毒(CSFV)强毒株和疫苗毒株，且与BVDV C24V株、PRRSV活疫苗TJ株、JEV活疫苗14-14-2株、PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗等病毒无交叉扩增反应。灵敏度检测可达10_5数量级，特异性强，对BVDV C24V株、PRRSV活疫苗TJ株、JEV活疫苗14-14-2株、PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株等结果阴性。在QuantStud1? 6Flex实时荧光定量PCR系统上操作简单易行。
【附图说明】
[0017]图1为实时荧光定量RT-PCR技术检测猪瘟病毒特异性鉴定扩增曲线图；
[0018]图1中，从左到右依次为:①CSFV石门株、②猪瘟活疫苗细胞源、③猪瘟活疫苗传代细胞源、④CSFV Thiverval株、⑤猪瘟活疫苗脾淋源，⑥BVDV C24V株、⑦PRRSV活疫苗TJ株、⑧JEV活疫苗14-14-2株、⑨PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株没有出现扩增曲线；
[0019]图2为特异性鉴定熔解曲线图(和图1相对应)；
[0020]图3为特异性鉴定电泳结果(和图1相对应)；
[0021 ] 图3中，M为DL500Marker，I为PBS阴性对照，2为DEPC水空白对照，3为猪瘟活疫苗细胞源，4为猪瘟活疫苗传代细胞源，5为猪瘟活疫苗脾淋源，6为CSFV Thiverval株，7为CSFV石门株，8为BVDV C24V株，9为PRRSV活疫苗TJ株，10为JEV活疫苗14-14-2株，11为PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株；
[0022]图4为实时荧光定量RT-PCR技术检测CSFV的灵敏度试验结果；
[0023]图4中，从左到右的稀释倍数依次是依次为10°、10' 10' 10' 10' 10' 10'空白对照；
[0024]图5为对12份送检血样荧光定量RT-PCR技术鉴别检测CSFV毒株的检测结果。
【具体实施方式】
[0025]以下结合图1?5，并通过具体实施例详细说明本发明的具体内容。以下依次通过特异性试验、灵敏度试验等阐述本实验方法的建立过程。
[0026]特异性试验
[0027]分别以①CSFV石门(Simen)株、②猪瘟活疫苗(细胞源)、③猪瘟活疫苗(传代细胞源)、④CSFV Thiverval株、⑤猪瘟活疫苗(脾淋源)，⑥BVDV C24V株、⑦PRRSV活疫苗TJ株、⑧JEV活疫苗14-14-2株、⑨PEDV/TGEV/PoRV三联活疫苗毒株的核酸为模板做CSFV的特异性鉴定，同时以PBS为阴性对照、DEPC水为空白对照。反转录反应体系使用TAKARA试剂盒，每条引物的终浓度为0.4 μ Mol/L，加入DEPC水将每个反应补充至25 μ I，反应条件为95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共40循环，CSFV特异性试验的结果如图1所示，仅CSFV毒株有扩增曲线；溶解曲线见图2 ;电泳结果见图3。
[0028]由图1?图3可知，采用该特异性引物扩增的非CSFV的RNA无特异性反应。
[0029]灵敏度实验
[0030]以病毒中和试验测定疫苗毒的TCID50，将疫苗毒十倍梯度稀释，提取RNA，在荧光定量PCR仪器上检测到扩增曲线的最大稀释倍数即为荧光定量PCR技术检测灵敏度，结果见图4。
[0031]以下为采用本发明的方法对12份送检血样荧光定量RT-PCR技术鉴别检测的具体过程及结果。
[0032]I)在GenBank中下载猪瘟病毒毒株的基因序列，用DNAstar软件进行序列分析，找到共同的保守片段，用PRimer5.0设计特异性引物3-UTR，其序列为:
[0033]3-UTR For:5，-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3，；
[0034]3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’ ；
[0035]2)采集12份血样进行编号，使用常规方法提取猪瘟病毒各毒株、疫苗(200 μ I)及其他病毒的总RNA ；
[0036]3)以提取的总RNA为模板，用30 μ I无RNA酶的DEPC水(0.1%)溶解RNA，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA ；
[0037]4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，将PCR产物3%琼脂进行电泳(野毒强毒株片段大小为99bp，疫苗毒PCR产物大小为115bp-140bp)。电泳结束后，取5μl在3%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果，根据记录结果鉴定样品猪瘟病毒野毒强毒株或疫苗弱毒株；
[0038]其中，特异性引物的终浓度为0.4 μ Mol/L，PCR反应条件为:95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共40循环。检测结果如图5所示。
[0039]其中，样品M为cDNA为样品模板，样品I为阴性对照，样品2为空白对照，样品3?10、12?14结果为阴性，样品11结果为阳性。
【主权项】
1.一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)设计特异性引物3-UTR，其序列为:3-UTR For:5’ -GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’ ；3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’ ； 2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA; 3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA； 4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4yMol/L，PCR反应条件为:95°C预变性30s, 950C变性5s, 600C退火30s，72°C延伸30s，共40循环。2.—种实时荧光定量RT-PCR鉴别检测猪瘟野毒强毒株的特异性引物，其特征在于:所述特异性引物的序列为:3-UTR For:5’ -GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’ ；3-UTR Rev:5’ -AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’。
【专利摘要】一种荧光定量RT-PCR实时鉴别检测猪瘟强毒株和疫苗毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计特异性引物3-UTR，其序列为：3-UTR For：5’-GTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；3-UTR Rev：5’-AGTTTATACCAGTTCTTACTCATTC-3’；2)对采集的血样进行编号，提取血样总RNA；3)以提取的总RNA为模板，用TARAKA试剂盒进行反转录得cDNA；4)以步骤3)反转录所得cDNA为模板，加入特异性引物，用TARAKA的SYBRgreen试剂盒进行荧光定量PCR扩增，记录实时荧光定量PCR扩增曲线、溶解曲线以及电泳结果，根据记录结果鉴别猪瘟病毒株；其中，特异性引物的终浓度为0.4μMol/L，PCR反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40循环。为猪瘟疫病控制及净化提供了可靠技术保障。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN104988243
【申请号】CN201510405978
【发明人】王钦富, 高金源, 胡亚萍, 刘欢, 王美辰
【申请人】大连大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月10日