Pcr-荧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药检测领域，尤其设及人体病毒检测领域，具体是指一种PCR-巧光 探针法检测人型支原体核酸试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[000引根据全国性病疫情报告，2003年31个省份共报告8种性病859040例，较上年增长 2. 59%。全国性病报告发病率为68. 91/10万，男女病例数之比为1.4:1。在全国8种报告 性病病种中，排在前5位的依次是淋病、非淋菌性尿道（宫颈）炎、尖锐湿扼、梅毒和生殖器 瘤疹。其中，淋病报告病例数较上年减少幅度最大，为16.22% ;非淋菌性尿道（宫颈）炎 较上年增加幅度最大，为31. 71%。在全国8种性病报告病例构成比中，淋病从1999年的 40. 72%降至33. 25%，非淋菌性尿道（宫颈）炎从1999年的21. 85%增至28. 06%。
[0003] 我国各地性病病种构成有所不同。除多数省性病病种排名同于全国外，在天津、 广东、广西、海南等省份，非淋菌性尿道（宫颈）炎的报告病例数已超过淋病而居性病的首 位。因此专家建议高度重视非淋菌性尿道（宫颈）炎的控制，将支原体感染作为单独一种 性病报告，同时对无症状感染者的筛查措施、药品与诊断试剂的生产供应计划，W及其他资 源配置等均应作出调整；应加强临床医疗服务工作，对病例实行快速有效治疗，并普遍开展 产前、婚前、收容入所前等筛查，及时控制传染源。
[0004] 非淋菌性尿道炎（NGU)也称非特异性尿道炎，有30%~40 %由支原体引起，包括 解脈支原体和人型支原体、生殖支原体感染。女性人型支原体感染主要表现为宫颈炎症和 糜烂、分泌物增多、外阴阴道搔痒、下腹部不适、产后发热、反复流产、死产W及造成新生儿 脑膜炎、肺炎等疾病；男性则为前列腺炎、尿道炎，典型的临床症状有尿道刺痒，伴轻重不等 的尿急、尿痛、排尿困难及不孕不育。
[0005] 目前人型支原体（Mycoplasmahominis，MH)最常用的鉴定产品为培养法、涂片检 查、血清学实验、胶体金等W。培养法是传统的检测方法，也是我国目前最常用的方法， 包括液体培养和固体培养两类。培养法是依据根据菌落形态、底物分解、抑值、生长速度鉴 定。根据培养基中的指示剂变色，比较简单易行。固体培养法优点是可W保存菌体进行后 续检测和研究例如计数、药物敏感试验和致病性研究等。涂片检查、血清学实验、胶体金等 方法是一种较快速的检测方法。
[0006] 化qman巧光PCR是上世纪90年代研制出的一项新技术。化qmanPCR引入特异 的巧光探针，该探针与PCR引物对内侧的一段序列同源。探针的5'端标有报告巧光，而在 3'端则标有泽灭巧光，当探针保持完整时，报告巧光发出的发射波长被泽灭巧光的激发波 长吸收，此时检测不到报告巧光的巧光信号；在PCR进行过程中，TaqDNA聚合酶的5' -3' 外切核酸活性可W将巧光探针切成单个碱基，使报告巧光不再受泽灭巧光的影响，报告巧 光的巧光信号可被检测到，并随着PCR循环数的增加而增加。通过构建已知拷贝数的系列 标准品的标准曲线就可W达到定量未知标本的目的。由于整个实验过程都是在完全封闭的 系统中运行，避免了交叉污染，使得结果更加客观真实，同时在扩增时结合了特异探针的杂 交，进一步提高了实验的敏感性和特异性，实时巧光PCR在性病检测的敏感度、灵敏度W及 准确性等方面优势比较明显，是目前检测常用的方法，可用来进行大规模的性病筛查和检 巧。，已被广泛采用。
[0007] 探针法检测MH的文献资料中有使用Gap化作为祀基因检巧U，但是通过 GenBank+EMBL+孤BJ+PDBsequences的数据库查询，MH的Gap化保守性较差，文献中采用的 引物探针并不能覆盖所有的型，而且采用2对引物探针组合，每个样本需要采用2个反应来 检测，增加了成本并且不够简便；有使用yidC作为祀基因检测，但缺乏合理的阴性、阳性对 照。
[0008] 针对人型支原体检测的专利已有数篇如下：一种培养鉴别致病支原体的试剂盒及 其制备方法（CN101109746A)、泌尿生殖道支原体培养基及检测方法（CN101555457A)、非淋 菌性尿道炎支原体快检试剂（CN10156662A)、快速检测支原体的固体培养基及其制备方法 (CN102409076A)、人型支原体金标快速检测试剂盒（CN104076147A)、沙眼衣原体、解脈支原 体和人型支原体联合检测试剂盒（CN204142733U)和用于同时检测解脈支原体、人型支原 体和生殖器支原体的组合物和试剂盒（CN101824471A)等，上述专利部分采用的是培养法 检测人型支原体，缺点是培养法鉴定费时较长（超过24小时），取材不当或培养条件掌握不 好容易出现假阴性，灵敏度低，鉴定需要从形态等方面分析一定的经验，由于从取材到培养 过程中时间长步骤多，也存在一定的假阳性；部分采用胶体金检测人型支原体，在人体感染 人型支原体的初期无法检测出来，存在较长的窗口期（2-4周），且存在灵敏度较低、特异性 不够等缺点；部分采用PCR巧光探针法检测同时检测解脈支原体、人型支原体和生殖器支 原体，针对人型支原体的16s核糖体RNA进行检测，由于细菌的16s核糖体RNA在进化上保 守，存在较高的同源性，特异性较低，造成假阳性。由于PCR巧光探针法检测灵敏度高，因此 经常会存在一些产物污染和非特异性扩增。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够实现快速、准确检 测的PCR-巧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒及其检测方法。
[0010] 为了实现上述目的，本发明的具有如下构成：
[0011] 该PCR-巧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包 括；核酸抽提组和核酸扩增检测组，所述的核酸扩增检测组包括PCR反应液、阴性对照和阳 性对照，所述的PCR反应液包括DNA聚合酶、UNG酶、反应缓冲液、引物、探针及Mg"，所述的 阳性对照包括阳性质粒和人基因组，所述的阴性对照包括人基因组，所述的探针为化qman 巧光探针。
[0012] 优选地，所述的核酸抽提组包括；核酸纯化柱、蛋白酶K、裂解液、洗柱液和洗脱 液，其中所述的核酸纯化柱包括硅胶模柱和收集管，所述的裂解液包括盐酸脈和=哲甲基 甲烧，所述的洗柱液包括氯化钢和己醇，所述的洗脱液为TE溶液。
[0013] 更优选地，所述的阴性对照为TE溶液。
[0014] 再次优选地，所述的人型支原体阳性对照为构建于pGEM-T载体上的包含序列为 SEQIDNo;l所示的核巧酸序列的质量DNA，所述的载体上包含序列为SEQIDNo;5所示的 人基因组DM序列。
[0015] 再一次优选地，所述的人型支原体阳性对照序列中包含序列为SEQIDNo;2所示 的上游引物位置核巧酸序列、序列为SEQIDNo;3所示的下游引物位置核巧酸序列和序列 为SEQIDNo;4所示的探针核巧酸序列；所述的人基因组DNA序列中包含序列为SEQID No;6所示的上游引物位置核巧酸序列、序列为SEQIDNo;7所示的下游引物位置核巧酸序 列和序列为SEQIDNo;8所示的探针核巧酸序列。
[0016] 进一步优选地，所述的引物探针包括人型支原体引物探针及0珠蛋白引物探针。
[0017] 更进一步优选地，所述的人型支原体引物序列探针包括序列为SEQIDNo;9所示 的上游引物核巧酸序列、序列为SEQIDNo;10所示的下游引物核巧酸序列和序列为SEQID No;11所示的探针核巧酸序列，其中所述的探针检测通道为FAM，其中5'修饰基团为FAM， 3'修饰基团为B册1。
[0018] 再进一步优选地，所述的0珠蛋白引物探针包括序列为SEQIDNo;12所示的上 游引物核巧酸序列、序列为SEQIDNo;13所示的下游引物核巧酸序列和序列为SEQIDNo: 14所示的探针核巧酸序列，其中所述的探针检测通道为JOE,其中5'修饰基团为JOE, 3'修 饰基团为B册1。
[0019] 最优选地，所述的试剂盒检测样本为男性泌尿道、女性生殖道分泌样本或新生儿 咽部等样本中的人型支原体DNA。
[0020] 根据所述的PCR-巧光探针法检测人型支原体核酸试剂盒的检测方法，其特征在 于，所述的检测方法包括：
[0021] (1)加样准备：将处理好的样本5yL加入PCR反应液45yL中待扩增；
[0022] (2)PCR扩增；将混合均匀的样本进行PCR扩增，并检测巧光信号；
[0023] (3)分析结果：在同时满足两个对照组标准的情况下，分析样本；
[0024] 其中所述的巧光检测步骤中将Baseline设为3~15,巧光阔值设定原则为阔值线 巧懈超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值显示为化det。
[00巧]优选地，所述的样本处理步骤包括：
[002引 2. 1从样本收集管中取1血液体转移至1. 5血的管中，120(H)巧m离屯、5分钟，弃上 清。
[0027] 2. 2沉淀中加入20ul蛋白酶K、150ul裂解液，打散沉淀，56°C解育10分钟。
[002引 2. 3在每个1. 5ml管子中加入450ul4°C预冷的无水己醇。
[0029] 2. 4将步骤3中的液体转移至核酸纯化柱中并套上收集管，12000g离屯、1分钟。
[0030] 2. 5弃去收集管中的液体，核酸纯化柱套上原收集管，加入700ul的洗柱液， 12000g离屯、30 秒。
[0031] 2. 6弃去收集管中的液体，核酸纯化柱套上原收集管，加入500ul的洗柱液， 12000g离屯、2分钟。
[0032] 2. 7弃去收集管，核酸纯化柱套上新的1. 5m化P管，加入50ul的洗脱液，56°C解育 2分钟。
[003引 2.812000g离屯、2分钟，1.5mlEP管中收集的液体即为纯化的核酸，用于PCR反应。
[0034] 更优选地，所述的PCR扩增步骤包括：
[0035](2. 1)样品设置；在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称、类型及 工作标准品参数。
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