一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】-种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒 【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地说，设及一种快速分析单细胞性染色体倍性的 方法和试剂盒。 【【背景技术】】
[0002] 体外受精一胚胎移植，简称试管婴儿技术，由于有机会在胚胎移植之前获得一个 胚胎的细胞，从而为胚胎的种植前遗传和性别筛选提供了条件。然而，在我国和很多欧洲国 家，法律不允许单纯进行性别筛选。但是，在一些国家，例如美国等，胚胎移植前的性别筛选 是法律所允许的。可是通过性别筛选，W排除性连锁遗传疾病，是法律所允许的。例如X染 色体增加一倍的47,XXYKlinefelter综合征，在男性新生儿中的发病率是1/850 ;X染色体 缺失一倍的女性45,X0,化rner综合征，在女婴中的发病率为1/2500-5000 ;除此之外，性连 锁遗传疾病还包括XYY综合征、多X综合征等。针对性染色体连锁疾病高危人群，在胚胎种 植前进行性别的遗传学筛选，可W避免遗传疾病的发生，该是符合医学伦理道德要求的。
[0003] 目前，对该类疾病的诊断方法包括细胞遗传学方法和分子遗传学方法。前者是 借助于染色体核型分析方法，对处于分裂中期的细胞进行分析，操作过程繁琐，常因细胞 培养污染等因素而影响结果判断，耗时长，不利于快速精确诊断；而且核型分析对于小于 4. 5Mb的染色体异常无法诊断，因此不适用于胚胎植入前诊断。另外一个方法是近年来发 展很快的分子遗传学方法，主要是将细胞遗传学技术与分子生物学技术相结合的一种方 法，它快速、敏感、特异性强，对许多遗传病的病因分析，致病基因的鉴定诊断等都具有重 要价值。包括单细胞性染色体倍性诊断的方法是巧光原位杂交（Fluorescenceinsi化 hybridization,FISH)技术和测序技术。FISH能检测的染色体数目有限，实验步骤长（长 于24小时），而且靠肉眼判断信号的"有"和"无"，准确性差。W上技术最近两年被巧片技 术取代，包括比较基因组杂交巧片（array-basedComparativeGenomicHybridization, arrayCGH)和单核巧酸多态（^singlenucleotidepolymo巧hism，SNP)巧片等，可同时检 测23对染色体的拷贝数W及某些结构异常。但是该样的巧片造价高，时程长（1-2天），而 且医院本身不能操作，要外送公司检测，增加了样本污染的机会，一个胚胎卵裂球的检测费 用大约在6000元人民币左右，对大多数试管婴儿患者并不适用。
[0004]总的来说，现有筛查方法的问题是费用高，时间长，周转实验室多。因此亟需一种 快速和准确的，专口针对X，Y性染色体倍性的检测，可在医院胚胎实验室应用的胚胎植入 前遗传学筛查方法。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性 的引物组合。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供所述的引物组合的用途。
[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性的试剂盒。
[0008] 本发明的第四个目的是，提供一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法。
[0009] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] 一种快速分析单细胞性染色体倍性的引物组合，所述的引物组合包含序列分别如 SEQIDNO. 1-6所示的引物。
[0011] 所述的引物组合还包含序列分别如SEQIDNO. 7-12所示的引物。
[0012] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] 如上任一所述的引物组合在制备快速分析单细胞性染色体倍性的试剂中的应用。
[0014] 为实现上述第S个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] 一种快速分析单细胞性染色体倍性的试剂盒，所述的试剂盒包含序列分别如SEQ IDNO. 1-6所示的引物。
[0016] 所述的试剂盒还包含序列分别如SEQIDNO. 7-12所示的引物。
[0017] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0018] 一种非治疗目的的快速分析单细胞性染色体倍性的方法，所述的方法包括W下步 骤：
[001引a)提取单细胞的全基因组DNA，加入分别针对X染色体、Y染色体和21号染色体 的序列如SEQIDNO. 1-6所示的引物，进行PCR预扩增；
[0020]b)W步骤a)的扩增产物为模板，分别使用针对X染色体、Y染色体和21号染色体 的套式引物进行实时巧光定量PCR;其中W针对21号染色体的引物作为内参，得出X染色 体DNA相对含量K=厂AGtW、Y染色体DNA相对含量L=厂&Gt(y)，W及X/Y=厂& ≫同 时设计标准男性对照组得到Ljifi和标准女性对照组得到Kwi;
[002。C)若男性标准品和女性标准品的K/L值在正常范围内，且阴性对照组Ct(x)和Ct(y)均大于25个周期，则进一步判断待试样本的K/L、K/Kwi、L/Lwi、和/或L/L ^值，得出待试样本的性染色体倍性。
[0022] 所述的针对X染色体、Y染色体和21号染色体的套式引物序列分别如SEQID NO. 7-12 所示。
[0023] 所述的非治疗目的可W是用于科学研究，所述的单细胞可W是来自于人体的任何 组织或体液等。
[0024] 本发明优点在于：
[0025] 本发明提供了一种快速分析单细胞性染色体倍性的方法和试剂盒。
[0026] -般的巧光定量PCR要求底物DNA的浓度在lOpgW上，最适浓度为l(K)pg，因此对 于单细胞值NA的浓度在5pgW下）的定量不能做出正确的诊断。本发明的方法解决了单 细胞定量的问题，首先均衡地扩增单细胞中X，Y染色体上的标记DNA，达到巧光定量PCR要 求的适合浓度范围后，再使用巧光定量PCR进行定量分析，最后得出性染色体相对拷贝数， 进一步分析得到性染色体倍性。
[0027] 1、本发明设计的引物之间不会发生非特异性的抑制作用，互相不干扰，能够均衡 的扩增单细胞X，Y染色体上的标记DNA，确保结果的准确性；
[0028] 2、本发明的方法分析了X，Y染色体的相对拷贝数，即进行了双重核对，准确性大 大提局；
[0029] 3、本发明的方法引入常染色体特定保守DNA片段作为内参，降低了假阳性率。
[0030] 与现有的染色体核型分析方法相比，本发明还具有W下优点：
[0031] 1、针对现有的诊断方法费用高的问题，本发明所需成本约为人民币200元/样 本；
[0032] 2、针对现有的诊断方法时间过长的问题，本发明所需时间约为两个小时；
[0033] 3、针对现有的诊断方法周转实验室过多的问题，本发明所需设备为一台PCR仪、 一台定量PCR仪、一台超净台。
[0034] 综上所述可知，本发明为染色体突变高危病人和性连锁疾病高危病人提供了胚胎 的遗传学诊断方法，可有效预防性染色体疾病在试管婴儿中出现。 【【附图说明】】
[0035] 附图1是本发明快速分析单细胞性染色体倍性的技术原理图。 【【具体实施方式】】
[0036] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0037] 实施例1
[00測 1.技术原理
[0039] 请参照图1，图1是本发明快速分析单细胞性染色体倍性的技术原理图。
[0040] 本发明的试剂盒是基于单细胞DNA扩增与实时定量PCR技术。首先将来自胚胎的 卵裂球或者胚胎滋养层细胞中的痕量DNA进行特别片段狂，Y和常染色体上的标志DNA片 段）等量扩增（第一轮扩增），再利用实时定量PCR(第二轮扩增）确定每个样本中标志DNA 片段的Ct值（达到饱和浓度所需要的周期数），ACt为标识基因与内源性参考基因Ct值 之差；AACt是两个标识基因Ct值之差。由于Ct值与底物模板浓度的对数存在反比例的 线性关系，即DNA相对量二厂& ，可W计算出每个标志dm与常染色体上标志DNA的相 对比例，获得性染色体相对拷贝数K化=X标识/常染色体标识）和L(L=Y标识/常染 色体标识）。每次检测均需要使用基因组男性、女性标准品和阴性对照组。对照组和实验组 卵裂球加入针对每个染色体标志基因的引物（