一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法及其分子标记引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域，具体设及一种利用分子标记预示和鉴定绵羊 超数排卵性状的方法。
【背景技术】
[000引超数排卵（MultipleOvulation,MO)技术是近30年来国际上发展很快的一项生 物高新技术，在畜牧业发达国家，羊的超数排卵技术自上世纪末就已从实验室逐步转入了 应用阶段。此项技术的应用使人们摆脱了过去对雌性动物的生殖研究和应用的限制，开始 挖掘和利用优良母畜的遗传潜力，利用该项技术可W在相对较短的时间里，从一只母羊获 得更多的后代，它可W比传统的方法加快几倍、几十倍繁殖优良种羊，该将大大提高优良种 群的繁殖效率，促进家畜改良，加速遗传进展；同时也为生殖细胞融合、体外受精、胚胎性别 鉴定、转基因技术、体细胞克隆等生物技术的研究提供基础，是上世纪继人工授精之后家畜 繁殖领域的又一次重大革命。
[0003] 随着超数排卵技术在畜牧生产中和科研工作中的广泛开展，一些影响其进一步发 展和提高的技术问题也日益显现。超数排卵效果不稳定已成为制约其进一步推广应用的首 要因素，即使供体母羊的品种、年龄、营养及生理状况，激素的来源、剂量，超数排卵的季节、 程序等均相同的情况下，超数排卵效果仍然会出现很大程度的差异，不同个体在获卵数上 变异很大，变异系数在40%左右，导致超数排卵的效率显著下降。
[0004] 随着现代分子遗传学技术的飞速发展，分子标记技术为解决该一问题提供了新的 思路。采用分子生物学技术方法可W避免年龄和环境的干扰来实现分子标记的基因型检 巧。，利用分子标记基因型信息可W准确的选择优质供体参加超数排卵处理，减小获卵数变 异，该样必将极大地加快育种进程，提高家畜生产效率。
[0005]促卵泡激素又名卵泡刺激素（Follicle-StimulatingHormone,FSH)，在生殖过程 中扮演着重要的角色，同时也是超数排卵处理过程中最为重要的一种外源补充激素。但促 卵泡激素本身不能直接透过细胞膜，必须与祀组织的颗粒细胞、内膜细胞上的促卵泡激素 受体（F甜rec巧tor,FSHR)结合，才能进入细胞内发挥其生物学作用。绵羊FS皿基因位于 3号染色体，Yarney等（1993)首先克隆了其cDNA序列，此序列包括长2085bp的开放阅读 框，编码678个氨基酸的成熟蛋白质（74, 580daltons;pl= 6. 78)。与已知的人和大鼠的 序列同源性超过90%。FS皿的mRNA位于卵泡颗粒细胞的表面，在卵泡发育初期、卵泡内膜 和基质膜形成W前，原始卵泡只有1~2层颗粒细胞时就能发现。FSHR与其配体结合，使颗 粒细胞或睾丸细管滋养层细胞cAMP浓度升高，使蛋白激酶A(PKA)活化，导致一些蛋白酶和 转录因子激活。转录因子cAMP反应元件结合蛋白和cAMP反应结合效应物被PKA磯酸化而 激活，与CRE(cAMP反应元件）结合，导致特定阶段的mRNA转录。
[0006] 因此，促卵泡激素受体基因（FSHR)可W被选定为候选基因，通过寻找其具有重要 功能的分子标记，并利用分子标记信息进行供体选择，对于提高绵羊超数排卵效率具有重 要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克隆绵羊促卵泡激素受体（FSHR)基因片段，鉴定其特定的突 变位点，而提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法及其分子标记引物。
[000引本发明根据绵羊FS皿基因5f调控区C.-3650T突变（C-365T)，采用引物单碱基 错配方式，巧妙设计了特异性引物FSHRPF和FSHRPR，成功屏蔽掉引物区域内基因组上的原 有干扰酶切位点，只保留扩增区段中用于C-365T突变检测的酶切位点。采用限制性内切酶 Sau3AI对C-365T突变位点进行检测分型，利用基因型信息与绵羊超数排卵性状的关联性， 提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法。
[0009] 本发明提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记引物，该分子标记引物 为F甜RPF和F甜RPR，F細RPF的序列如序列表SeqIDNo;1所示，F甜RPR的序列如序列表 SeqIDNo;2 所示。
[0010] 本发明的一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法，它是按照W下步骤 进行的：
[0011] 一、W提取的绵羊基因组DNA为模板，采用FSHRPF和FSHWR引物，进行PCR扩增， 收集PCR产物；取PCR产物进行凝胶电泳检测，并采用Sau3AI限制性内切酶对PCR产物进 行酶切，获得酶切产物；
[0012] 二、使用浓度为3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行分离，然后根据电泳分离结果 进行基因型判定；判定的标准为：①电泳后呈现单一条带，大小为138bp，则绵羊FS皿基因 5 ^调控区段-365位点未突变，碱基为C，PCR扩增产物不能够被限制性内切酶Sau3AI酶 切，将其命名为AA基因型；②电泳后呈现两条带，大小分别为138bp和26bp，则绵羊FS皿基 因5 ^调控区段-365位点发生突变，碱基为T，PCR扩增产物能够被限制性内切酶Sau3AI 完全酶切，将其命名为BB基因型；⑨电泳后呈现S条带，大小分别为138bp，112bp和26bp， 贝IJ绵羊FS皿基因5M周控区段-365位点处于杂合状态，碱基为C和T，PCR扩增产物只能 够被限制性内切酶Sau3AI部分酶切，将其命名为AB基因型；
[0013] S、构造W下线性模型；Y=y+G+L+H+6 ;其中；Y代表相关性状的记录值；y代表 群体的平均值；G代表基因型固定效应；L代表品种固定效应；H代表场年季固定效应；e代 表随机残差效应；然后利用SAS6. 12软件包将基因型固定效应与超数排卵状进行关联分 析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，对于卵巢上排卵点数量，各基因型群 体间为BB>AB>AA;BB型群体绵羊胚胎受精率和优良胚胎率的均值高于AA型和AB型群 体；在移植妊娠率方面，WAB型群体均值最高；
[0014] 四、依据基因型将绵羊供体分为S种类型，选择BB基因型绵羊供体参与超数排卵 处理，从而实现对绵羊超数排卵数的分子标记辅助选择，即完成预示和鉴定绵羊超数排卵 性状的分子标记方法；所述的FSHRPF的序列如序列表SeqIDNo;1所示，FSHWR的序列如 序列表SeqIDNo;2所示。
[00巧]本发明的F甜RPF引物序列为：AGCGAGAGAGACATCAGTGAC'FSHRPR引物序列为； GCAGTGTGAAACATCATTAAGA〇
[0016] 本发明具有W下有益效果：
[0017] 本发明最主要的特点是；1、利用绵羊FS皿基因5f调控区的C-365T突变与绵 羊超数排卵性状的关联性，进行预示和鉴定绵羊超数排卵性状；2、本发明在设计分子标 记引物中，采用引入单碱基错配方式，屏蔽掉引物区域内基因组上的原有干扰酶切位点， 只保留扩增区段中用于C-365T突变检测的酶切位点，使本发明的分子标记方法能够进行 PCR-RLFP分析，具有费用低，准确率高的优势。
[0018] 本发明的方法操作简单，检测费用低，精确度高，并适合于自动化检测。使用本发 明的分子标记方法完成绵羊超数排卵过程中供体的选择，获卵数提高2. 87枚，减小了性状 的变异，提高了绵羊超数排卵的效率。应用本发明方法进行分子标记辅助选择，必将极大地 加快育种进程，提高绵羊生产效率。并为生殖细胞融合、转基因技术、体细胞克隆等生物技 术的研究提供更多的优质卵子。
【附图说明】
[0019] 图1为绵羊FS皿基因5 ^调控区的PCR扩增产物经3%的琼脂糖凝胶电泳检测结 果。其中，M泳道为标准分子量Marker, 1-10泳道为被检测的10个PCR产物。
[0020] 图2为绵羊FS皿基因5 ^调控区段C-365T多态位点酶切分型结果。其中，M泳 道为标准分子量13'1?51'，1、3、5、7、9、10泳道为44型个体，2、4、6泳道为48型个体，8泳道 为BB型个体。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0021] 一；本实施方式的一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记引 物，该分子标记引物为FSHRPF和FSHRPR，FSHRPF的序列如序列表SeqIDNo;1所