一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法及其分子标记引物的制作方法_2

文档序号:9271090阅读:来源:国知局
示,FSHRPR 的序列如序列表SeqIDNo;2所示。
【具体实施方式】 [0022] 二;本实施方式与一不同的是;所述的分子标记引物 中的是FSHRPF引物通过W下方式设计的:采用引物单碱基错配方式,在FSHRPF引物序列上 设计CATC碱基,屏蔽掉引物区域内基因组上的Sau3AI干扰酶切位点,只保留用于C-365T 突变检测的酶切位点。其它与一相同。
[002引【具体实施方式】S;本实施方式该分子标记方法是利用绵羊FS皿基因5 ^调控区C.-365的C〉T突变位点进行分型,从而预示和鉴定绵羊超数排卵性状。
【具体实施方式】 [0024] 四;本实施方式与=不同的是;预示和鉴定绵羊超数 排卵性状的分子标记方法,它是按照W下步骤进行的:
[0025] 一、W提取的绵羊基因组DNA为模板,采用FSHRPF和FSHWR引物,进行PCR扩增, 收集PCR产物;取PCR产物进行凝胶电泳检测,并采用Sau3AI限制性内切酶对PCR产物进 行酶切,获得酶切产物;
[0026] 二、使用浓度为3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行分离,然后根据电泳分离结果 进行基因型判定;判定的标准为:①电泳后呈现单一条带,大小为138bp,则绵羊FS皿基因 5 ^调控区段-365位点未突变,碱基为C,PCR扩增产物不能够被限制性内切酶Sau3AI酶 切,将其命名为AA基因型;②电泳后呈现两条带,大小分别为138bp和26bp,则绵羊FS皿基 因5 ^调控区段-365位点发生突变,碱基为T,PCR扩增产物能够被限制性内切酶Sau3AI 完全酶切,将其命名为BB基因型;⑨电泳后呈现S条带,大小分别为138bp,112bp和26bp, 贝IJ绵羊FS皿基因5M周控区段-365位点处于杂合状态,碱基为C和T,PCR扩增产物只能 够被限制性内切酶Sau3AI部分酶切,将其命名为AB基因型;
[0027] S、构造W下线性模型;Y=y+G+L+H+6;其中;Y代表相关性状的记录值;y代表 群体的平均值;G代表基因型固定效应;L代表品种固定效应;H代表场年季固定效应;e代 表随机残差效应;然后利用SAS6. 12软件包将基因型固定效应与超数排卵状进行关联分 析,并估计性状的最小二乘均值,关联分析结果表明,对于卵巢上排卵点数量,各基因型群 体间为BB>AB>AA;BB型群体绵羊胚胎受精率和优良胚胎率的均值高于AA型和AB型群 体;在移植妊娠率方面,WAB型群体均值最高;
[002引四、依据基因型将绵羊供体分为S种类型,选择BB基因型绵羊供体参与超数排卵 处理,从而实现对绵羊超数排卵数的分子标记辅助选择,即完成预示和鉴定绵羊超数排卵 性状的分子标记方法;所述的FSHRPF的序列如序列表SeqIDNo;1所示,FSHWR的序列如 序列表SeqIDNo;2所示。其它与【具体实施方式】=相同。
[0029]所述的供体为实验群体,所述的实验群体为:①32只澳洲美利奴品种,28只德国 肉用美利奴品种,19只萨福克品种,16只特克塞尔品种,14只夏洛莱品种,36只东北细毛 羊;②均为母羊;⑨所有结果为=年内分析完成。
[0030]所述的S种类型为AA基因型、BB基因型和AB基因型。
【具体实施方式】 [0031] 五;本实施方式与=不同的是;步骤=构造线性模型 是依据实验群体的特点,所述的实验群体的特点为:①32只澳洲美利奴品种,28只德国肉 用美利奴品种,19只萨福克品种,16只特克塞尔品种,14只夏洛莱品种,36只东北细毛羊; ②均为母羊;⑨所有结果为=年内分析完成。其它与=相同。
【具体实施方式】 [0032] 六;本实施方式与=不同的是;步骤=中的关联分析 结果表明:对于卵巢上排卵点数量,各基因型群体间为BB>AB>AA;不同基因型对卵巢上 排卵数量存在显著的影响,其中,P<〇. 05 ;BB型群体绵羊胚胎受精率和优良胚胎率的均值 高于AA型和AB型群体,但差异不显著,其中,P〉0. 05 ;在移植妊娠率方面,WAB型群体均值 最高,但S种基因型间差异不显著,其中,P〉0. 05。其它与S相同。
【具体实施方式】 [0033] 走;本实施方式与S不同的是:步骤一中PCR扩增体 系为20y1,PCR反应体系如下;
[0034]
[0035]PCR扩增条件为;94°C预变性5min,94°C变性30s,59°C退火30s,72°C延伸30s,共 30个循环,再72°C延伸7min,4°C保温。
[0036] 其它与【具体实施方式】S相同。
【具体实施方式】 [0037] 八;本实施方式与=不同的是;步骤一中采用Sau3AI 限制性内切酶进行酶切的体系为10. 0y1,反应体系如下:
[00%]
[0039] 酶切反应条件为;37°C酶切12h。
[0040] 其它与【具体实施方式】S相同。
【具体实施方式】 [0041] 九;本实施方式与=不同的是;步骤一中采用Sau3AI 限制性内切酶对PCR产物进行酶切是指使用限制性内切酶Sau3AI对PCR产物的C-365T突 变位点进行酶切。其它与=相同。
[0042] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容,其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可W实现发明的目的。
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0045] 实施例;
[0046] 1.提取绵羊基因组DNA
[0047] (1)剪取约6mg耳组织样放入一新离屯、管中,用眼科剪尽量剪碎,真空抽干机抽干 lOminW除去己醇,加入700y1组织DNA提取液,混匀。
[0048] (2)加入蛋白酶K至终浓度200 y g/ml,55°C消化过夜。
[0049] (3)加入等体积Tris-饱和酪,缓慢颠倒离屯、管lOmin,12000巧m离屯、lOmin。用 头端部分剪去0. 5cm的枪头小屯、将上清液移至另一干净离屯、管(如果所得溶液不清澈,可 重复此步骤一次)。
[0050](4)加入等体积的酪;氯仿(1:1),缓慢颠倒离屯、管lOmin,12000巧m离屯、lOmin, 用头端部分剪去0. 5cm的枪头小屯、将上清液移至另一干净离屯、管。
[CK)5U(5)加入等体积的氯仿,缓慢颠倒离屯、管lOmin,1200化pm离屯、lOmin,用头端部分 剪去0. 5cm的枪头小屯、将上清液移至另一干净离屯、管。
[0化引 (6)加入两倍体积预冷的无水己醇,离屯、管颠倒混合均匀,600化pm离屯、5min。[0化3] (7)倒掉上清液,加入1ml70%己醇洗漆一次。
[0化4] (8)6000巧m离屯、5min,倒掉管中己醇,空气中惊干lOmin。
[005引 (9)加入适量TE溶解DNA。
[0化6] (10)0. 7%琼脂糖凝胶电泳初步检测浓度和纯度。-20°C保存待用。
[0化7] 2、建立PCR反应体系
[0化8]PCR扩增体系为20y1,PCR反应体系如下;
[0059]
[0060] 具体引物的核巧酸序列为;FSHRPF-AGCGAGAGAGACATCAGTGAC, FSHRPR-GCAGTGTGAAACATCATTAAGA〇
[0061] 1、建立PCR反应程序
[0062]
[0063]
[0064] PCR扩增所得产物利用3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,见图1,其中,M泳道为标 准分子量Marker, 1-10泳道为被检测的10个PCR产物。结果表明;产物与预期大小一致, 条带单一,无非特异性扩增杂带,扩增效率很高,可W用于下一步酶切分型。
[0065] 4、建立PCR-RFLP酶切体系采用Sau3AI限制性内切酶进行酶切的体系为10. 0y1, 反应体系如下:
[0066]
[0067] 酶切反应条件为;37°C酶切12h。
[0068]PCR扩增产物经Sau3AI限制性内切酶37°C酶切12h,利用3%的琼脂糖凝胶电泳 检测,结果产生3种基因型,见图2。其中,M泳道为标准
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