用于五倍子蜂蜜的实时荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分子学领域，具体涉及针对五倍子树ITS序列设计并筛选出的一组特异引物和探针，用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质。蜂蜜含有丰富的必需氨基酸、维生素、多酚类、类黄酮类、多糖、活性酶和类胡萝卜素等活性物质，具有多种生理功能，如抗氧化、抗菌、加速创伤修复和增强免疫等。
[0003]五倍子蜂蜜是中药材蜜种，也是难得的森林蜜种，具有解毒、止腹泻、杀菌及收敛作用，对肺肾双虚，脾肾虚寒，气促喘乏，痰火郁肺有良好辅疗效果，特别适合虚汗、肺虚、肾虚、久泻久痢、痔血、便血等人士日常食疗保健之用；市场需求较大，五倍子蜂蜜市场售价是普通蜂蜜价格的3-5倍，市场上出现较多以常见廉价蜂蜜假冒五倍子蜂蜜产品的现象，极大的损害消费者利益，亟待建立切实可靠的五倍子蜂蜜鉴别技术。
[0004]目前，蜂蜜种类鉴别技术有感官分析、花粉分析、常规理化分析、色谱、光谱等鉴别技术。我国已有检测真假蜂蜜的国家标准方法，即采用稳定同位素质谱仪测定蜂蜜中的碳-4-植物糖，但是，质谱仪的价格通常在100万左右，价格较贵，另外，在测定时，由于五倍子树有相近似的属种，因此，在检测时，需要不断筛选，寻找出五倍子蜂蜜的蜜源植物，且试剂较贵，因此，对企业来说，检测的方法难度大，由于以上两点，现有的稳定同位素质谱仪的方法难以在企业中推广。
[0005]实时荧光PCR技术是近年来兴起的分子检测技术，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq emzyme)、4种脱氧核酸苷酸(dNTP)等成分，同时在PCR反应体系中加入焚光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行定性或定量定量分析的方法。目前，实时荧光PCR技术已经广泛应用，例如:公开号为CN103014172A、名称为一种检测甘蔗黄锈病菌的实时荧光定量PCR方法的中国发明专利，则公开了甘蔗黄锈病菌的检测，且PCR仪通常只需要10万、20万左右的即可，且检测时，仅需要将样品提取后的DNA与反应预混液、设计好的引物、探针、灭菌去离子水等加入反应混合液中，放入PCR仪中即可，操作简单方便且价格便宜，由此可见，如果用PCR技术检测五倍子蜂蜜的DNA提取模板，则可针对性的定性、定量鉴别五倍子蜂蜜的DNA，从而判定其真假，且价格便宜、检测方法简单，适于企业推广。目前为止，未发现有类似的报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题提供一种价格便宜、检测难度低的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，包括反应混合液，反应混合液中包括第一引物、第二引物和探针， 第一引物的基因序列为:AAACCTGCCTAGCAGAACGA ；
第二引物的基因序列为:TAAGATTTCCTTGGCGCAAT ；
探针的基因序列为:
ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA ；
探针的基因序列两端分别设置有荧光基团、荧光淬灭基团。
[0008]采用本发明技术方案的用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法，应用荧光探针原理，加入一对五倍子树的特异性引物和一条特异性焚光双标记探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，PCR反应预混液中通常含有DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂。荧光基团连接在探针基因序列的5’末端，淬灭基团标记在探针基因序列的3’末端。当探针为完整时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；而当探针与五倍子的DNA待测模板中的部分基因序列配对后，在DNA聚合酶的作用下，进行延伸时，DNA聚合酶的5’外切酶活性将探针的酶切位点进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号；引物则实现DNA待测模板、探针的扩增和延伸，进而通过检测增强的荧光信号来进行结果判定。本方法相比现有的稳定同位素质谱仪的方式，特异性强、灵敏度高，可提高结果准确性，从分子层面解决蜂蜜蜜源植物问题，且价格相对较低，检测难度低，可针对性检测DNA待测模板，避免不断筛选，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
[0009]进一步，所述的荧光基团、荧光淬灭基团分别为FAM、TAMRA。FAM、TAMRA较常用，且灵敏度高。
[0010]进一步，所述的PCR反应预混液的初始浓度为:2 X荧光PCR反应预混液。采用2倍反应预混液，在反应时，配置为I倍的荧光PCR反应预混液，操作方便。
[0011]进一步，所述的反应混合液中的各组分浓度为:10 yL 2X荧光PCR反应预混液，
0.4 yL浓度为10 μ mol/L的第一引物，0.4 yL浓度为10ymol/L的第二引物，0.8 μ L浓度为10 μ mol/L的探针，4 μ L DNA, 4.4 μ L灭菌去离子水。
[0012]进一步，反应的热循环参数为:
第一步:95°C 30s ；
第二步:95°C 5s，60°C 30s,40 个循环；
60°C时设置FAM荧光通道采集荧光。此参数操作时，所用时间短，效率高。
【附图说明】
[0013]下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明:
图1为本发明用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法实施例的荧光扩增曲线图；
图2是本发明的实施例的Ct检测结果图；
图3是本发明实验一的荧光扩增曲线图；
图4为本发明实验一的Ct检测结果图；
图5为本发明实验二的荧光扩增曲线图；
图6为本发明实验二的Ct检测结果图。
【具体实施方式】
[0014]实施例:
一、引物探针的设计和合成
参照GeneBank美国国家生物技术信息中心中盐肤木属物种基因序列，挑选种内保守、种间特异的ITS序列(GeneBank N0.AY641480.1 )，针对该基因，利用软件primerExpress3.0设计引物及探针，最后经过比较筛选确定的一对引物序列为:
Seql:AAACCTGCCTAGCAGAACGASeq2:TAAGATTTCCTTGGCGCAAT探针的序列为:
FAM-ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA-TAMRA ；
FAM为荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
[0015]二、检测步骤:
本发明用于五倍子蜂蜜的实时荧光PCR检测方法的具体操作:
I)配制反应液:在试剂准备区配制反应混合液，各组分浓度体积如下:10 μ L 2Χ荧光PCR反应预混液，0.4 UL引物Seql (浓度为10 μ mol/L)，0.4 μ L引物Seq2 (浓度为10 μ mol/L)，0.8 μ LTaqMan 探针 Seq3 (浓度为 10 μ mol/L)，灭菌去离子水 4.4 μ L0 焚光PCR反应预混液采购自宝生物(大连)有限公司，货号为RR390。同时设置阳性对照(即五倍子树)、阴性对照(