鱼类类立克次氏体特异性pcr检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及养殖领域，特别设及引起鱼类结节病类立克次氏体特异性PCR快速检 测试剂盒及检测方法，即一种鱼类结节病类立克次氏体的基因检测试剂及检测方法，适用 于鱼类类立克次氏体的流行病学监测、类立克次氏体的检测及基因工程技术等领域。
【背景技术】
[0002] 对于水产养殖动物，已明确立克次氏体是具有病原学意义的，但目前尚无具体为 某种立克次氏体引起水产养殖动物病害的明确记述，常W类立克次氏体巧ickettsia-like organisms,化0)予W记述和报道。
[0003] 类立克次氏体为多形性，但主要是球形的革兰氏阴性菌，直径为0. 5~1. 5ym，专 性细胞内增生，在宿主组织细胞有膜结合的胞质空泡内复制。
[0004] 1994年，化ern等曾报道，类立克次氏体于1992年10月至1993年2月间在中国台 湾引起罗非鱼大批发病死亡，病变主要是所有器官存在白色结节和显微肉芽肿，脾脏肿胀。 1995年姜明等在患真觸（Pagrosomusmajor)病毒病的病鱼肠上皮组织中检测出类立克次 氏体。2000年，化en等报道了中国台湾养殖的石斑鱼感染了类立克次氏体。该种高致死率 的病害已使中国的海水及淡水养殖业遭受了巨大损失。目前世界许多国家和地区都已发现 寄生在鱼体内的类立克次氏体，感染的鱼类有罗非鱼、海妒、石斑鱼、真觸、虹轉、大西洋蛙、 银蛙鱼、大麻哈鱼等。
[0005] 对于鱼类类立克次氏体的检测和鉴定，主要通过细胞分离培养、组织印片染色观 察、组织切片、核酸探针W及免疫学的方法。但该些方法有的准确率低，有的耗时长，有的敏 感性差。为了及早发现养殖鱼类是否被类立克次氏体感染，有必要建立一种快速、准确、灵 敏的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物 的检测与研究中。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鱼类类立克次氏 体特异性PCR检测方法，能快速、高效地用于鱼类类立克次氏体的检测。
[0007] 本发明通过下述技术方案实现的。
[0008] 一种鱼类类立克次氏体的PCR快速检测试剂盒，所述试剂盒包括；
[0009] (1)2X反应混合缓冲液，包含W下成分；KC1，MgCls，Tris-HCl，抑5. 8,dNTP;
[0010] 似检测引物的设计合成；根据GenBank中发布的鱼类类立克次氏体的基因序 列，设计一对特异性检测引物，上游引物化0-F;5' -TAGGAGATGAGCCCGCGTTG-3'，下游引物 化0-R;5> -ATTTCACATCCAACTTMTCT-3> ;
[0011] (3)TaqDM聚合酶；
[001引 （4)灭菌的dd&O;
[001引 妨阳性对照液泡类类立克次氏体基因组DNA;
[0014] (6)阴性对照液；dd&O。
[0015] 采用试剂盒检测鱼类类立克次氏体的方法为：
[0016] (1)鱼类类立克次氏体DNA的提取；取肝脏、脾脏、肾脏组织，加入灭菌处理的双蒸 水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20°C冰箱反复冻融3次，600化pm低温离屯、10分钟，取 上清，加入Tris-饱和酪，充分振荡混匀后，静置5分钟，然后1200化pm离屯、5分钟，取上清 液加入等量的酪；氯仿；异戊醇抽提二次，取上清加入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10 分钟，12000巧m离屯、10分钟，去掉上清后，加入75 %的己醇，静置5分钟，12000巧m离屯、10 分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥后，用灭菌的d地2〇溶解，即为试验用DNA模板，提取 的DNA模板置于-70°C保存备用；
[0017] (2)PCR反应体系；采用PCR反应体系，在PCR反应管内分别加入2X反应混合缓冲 液，上游引物、下游引物，5U/ULTaqDNA聚合酶，DNA模板，用灭菌超纯水加至总体积，同时 分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离屯、数秒， 置于PCR反应仪上；
[001引 （4)PCR反应条件；95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共循环30次；72 °C延伸10分钟，最后4°C保存；
[001引 巧)PCR扩增产物的检测；PCR反应结束后，取产物在1. 5%琼脂糖凝胶上，1. 5%琼 脂糖凝胶中含漠化己锭，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；
[0020] 做结果与判定；在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在39化P处 出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为类立克次氏体阳性；若阳性对照可见目的 条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的类立克次氏体。
[0021] 优选的试剂盒包括：
[002引 （1)2X反应混合缓冲液1.OmL，包含W下成分：
[0023]
[0024] (2)检测引物的设计合成：根据GenBank中发布的鱼类类立克次氏体的基因序 列，设计一对特异性检测引物，上游引物化0-F;5' -TAGGAGATGAGCCCGCGTTG-3'，下游引物 化0-R;5' -ATTTCACATCCAACTTAATCT-3'，浓度为10yM;
[00巧](3)hqDNA聚合酶5U/yL;
[0026] (4)灭菌的d地2〇 1. 0血；
[0027] 妨阳性对照液泡类类立克次氏体基因组DNA;
[0028] (6)阴性对照液；dd&O。
[0029] 采用试剂盒检测鱼类类立克次氏体的优选方法方法为：
[0030](1)鱼类类立克次氏体DNA的提取：取50-100mg的肝脏、脾脏、肾脏组织，加 入600yL灭菌处理的双蒸水，用玻璃匀浆器充分研磨后，置于-20°C冰箱反复冻融3次， 6000巧m低温离屯、10分钟，取上清，加入200yLTris-饱和酪，充分振荡混匀后，静置5分 钟，然后120(K)巧m离屯、5分钟，取上清液加入等量的酪；氯仿；异戊醇抽提二次，取上清加 入2倍体积的异丙醇，混匀后，静置10分钟，12000巧m离屯、10分钟，去掉上清后，加入ImL 预冷的75%的己醇，静置5分钟，12000rpm离屯、10分钟，去掉上清，置于真空干燥箱干燥 后，用100化灭菌的dd&O溶解，即为试验用DNA模板，提取的DNA模板置于-70°C保存备 用；
[0031] (2)PCR反应体系；采用20yL的PCR反应体系，在0. 2血PCR反应管内分别加入 2X反应混合缓冲液10yL，上游引物、下游引物各0.5yL，抓/yLTaqDNA聚合酶0.5yL，DNA模板3. 0yL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模 板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离屯、数秒，置于PCR反应仪上；
[003引（4)PCR反应条件；95°C预变性5分钟；然后95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共循环30次；72 °C延伸10分钟，最后4°C保存；
[003引 巧)PCR扩增产物的检测；PCR反应结束后，取10化产物在1. 5%琼脂糖凝胶上， 1. 5%琼脂糖凝胶中含漠化己锭，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物， 检查PCR产物的预期大小；
[0034] 做结果与判定；在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在3Wbp处 出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为类立克次氏体阳性；若阳性对照可见目的 条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的类立克次氏体。 [00巧]与现有技术相比，本发明所述的鱼类结节病病原类立克次氏体的特异性PCR快速 检测试剂盒及其检测方法具有W下特点及优点：
[0036] (1)本发明采用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR)技术检测鱼 类结节病病原类立克次氏体的方法，适用于对鱼类类立克次氏体进行快速检测。
[0037] (2)与现有技术相比，本发明的有益效果包括；①检测快速、效率高；从核酸提取、 聚合酶链反应（PCR)到结