专利名称：一种百草枯半定量速测试剂条的制备与应用的制作方法
一种百草枯半定量速测试剂条的制备与应用技术领域一种百草枯半定量速测试剂条的制备与应用，属于生物技术领域。
技术背景百草枯(paraquat, PQ)又名克无踪、对草快，是一种广谱、灭生性有机杂 环类除草剂。百草枯可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收，易导致肺纤维化。为了 保护人类健康和环境安全，许多国家严格限制使用百草枯。我国2005年发布并 实施的国家标准——食品中最大农药残留限量中规定蔬菜、柑橘、小麦粉中百 草枯的最大残留限量分别为0.05、 0.2、 0.5ppm。百草枯是目前全世界使用最广泛也是毒性最大的除草剂之一 (人口服致死 量为30 40 mg/kg，有害浓度>0.1 mg/mL)。 1966年，英国Bullivant首先描述 两例PQ意外中毒死亡事件，随后，世界各地相继报道PQ中毒病例，在最近30 年全球出现了较多的PQ急慢性中毒，特别是在农村地区。PQ中毒总病死率为 20% 75%, 口服20y。PQ病死率更高达60。/。 87.7。/。，已引起世界关注。由于PQ正广泛应用于农业，其中毒必将逐渐增多，有可能会存在于粮油作 物和一些食品原料中，即使在非致害水平下，也会对人体健康产生潜在危害。 由于百草枯的滥用，使其在环境中长久残留，尽管被土壤微弱吸附，但由于它 的高水溶性，因此对水体存在潜在的污染。百草枯对绿色植物组织有很强的破 坏作用，对人畜有较强的毒性，损害肺、肝、肾、心脏等脏器。因此，及时检 测并制定相关的限量标准已成为世界各国都非常重视的问题。有关百草枯的检测方法主要包括气相色谱、液相色谱、分光光度法、毛细 管电泳法、酶联免疫法、免疫传感器法等。1975年，Khan SU报道了利用气相 色谱(GC)检测莴苣、萝卜和洋葱中的百草枯。百草枯是一种极性很强的离子 型化合物，比较适合用高效液相色谱(HPLC)进行分析，因此利用液相色谱检 测百草枯的报道较多。百草枯不仅本身含有共轭结构，而且它可以被较强的还 原剂还原成多种有色物质，所以分光光度法是检测百草枯的常用经典方法。早 在1981年，Anthony F.Fell等就利用二阶和四阶导数分光光度法分析血清、血浆 中的百草枯。高效毛细管电泳(HPCE)亦即毛细管电泳，是一种发展迅猛的新 型的分离分析技术，1992年，MasafUmiTomita等利用毛细管电泳同时检测血清 中的对草快(PQ)和敌草快(DQ)，检测灵敏度为0.05|ig/mL。活生物体分析 法是从自然界筛选对生长环境中有毒化合物敏感的物种，作为环境监测的工具。 Rioboo等用淡水微藻C.Moewusii和C.Vulgaris检测水中百草枯和乙丙隆。免疫化学的定量检测方法主要包括放射免疫法(RIA)，间接竞争ELISA (icELISA)， 直接竞争法(dcELISA)，夹心免疫法(Sandwich IA)。最早建立的农药免疫法 中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2，4，5-T、对硫磷和百 草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性 防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后报道的农药免疫分析 文章，主要是酶免疫分析法。金免疫层析技术(Gold immunochromatography assay, GICA)是一种将纳米金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固 相标记免疫检测技术。纳米金标记抗体的技术在临床检验上已得到广泛和成功 的运用，如早早孕(HCG)检测试纸，乙肝表面抗原(HbsAg)检测试纸。而 纳米金技术检测小分子化合物也有成功的产品，如吗啡纳米金检测试剂盒和痩 肉精纳米金检测试剂盒等。另外，国外已有关于百草枯抗体(单抗或多抗)制 备的文献报道。本发明通过将百草枯完全抗原、羊抗兔IgG以条带状分别包被于硝酸纤维 膜的检测区(T)和质控区(C)，用纳米金标记抗百草枯抗体，并将其吸附于金 标垫上，成功建立了快速、特异、灵敏的检测百草枯抗原的纳米金免疫层析试 纸条(GICA)。 发明内容本发明的目的是提供一种百草枯半定量速测试剂条的制备与应用，成功建 立了快速、特异、灵敏的检测百草枯抗原的纳米金免疫层析试纸条(GICA)。本发明的技术方案 一种百草枯半定量速测试剂条的制备方法，该测试条 由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水纸四部分组成；将制备好的金标抗体调 成As2ton二1.0的浓度，喷涂于金标垫上，37'C真空干燥后备用；用自动点样仪对 硝酸纤维膜进行检测线性包被，下端横线检测线T包被百草枯人工抗原 PQ-h-OVA，浓度为0.5 mg/mL;上端横线质控线C包被羊抗兔IgG，浓度为O.ll mg/mL， 37t:真空干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水纸四部 分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以宽3.5mm/条切条后备用，即为百草枯半定 量速测试剂条。制备的百草枯半定量速测试剂条的应用方法，用其对试样进行检测(1) 小麦、玉米或大豆为检测试样准确称取2g粉碎均匀的试样，置于50 mL离心管中，加入2mL超纯水，摇匀，4200rpm离心15 min，将上层清液取出， 取75 pL用试纸条检测。(2) 蔬菜或水果为检测试样将蔬菜或水果洗干净，称2.5 g样品于15 mL 的离心管中，加入2~5 mL 6N的HC1，超声波提取20 min，然后将酸提取物离心 后取上清液，利用旋转蒸发仪蒸干，然后用适量PBS溶解，取75^L用试纸条检测。(3)水样或葡萄酒为检测试样不经前处理，可直接取75 pL用试纸条进行检测。本发明的有益效果本发明为实现我国粮谷、蔬菜及其制品中百草枯的快 速检测开辟了广泛的应用前景，这种新型免疫速测产品的研制，不仅降低了检 测成本，更为检测人员提供了安全检测的条件，具有简便、快速、灵敏度高、 特异性好，安全、环保等优点。
图1:制作工艺流程。图2:测试条组装及检测示意图。图3:检测百草枯标准溶液(ng/mL)的金标试剂条。
具体实施方式
实施例l:大豆中百草枯检测-1前处理准确称取2 g粉碎均匀的样品于50 mL离心管中，加入2 mL超纯水，摇匀， 4200 rpm，离心15min，将上层清液取出，必要时可对上清液进行稀释，进行检2百草枯半定量速测试剂条产品的使用方法取样品滤液75 jiL缓慢滴加于试纸条的加样孔中，5~30 min内观察试纸条 上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定 样品提取液中百草枯的含量若只有C线显色则判定样液为阳性(大于0.05 mg/kg)，百草枯超标；若C、 T线均显色则判定样液为阴性(小于0.05 mg/kg)， 百草枯没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。3检测结果T线红色色带消失，小麦样品中百草枯含量大于0.05mg/kg。 实施例2:青菜中百草枯检测-1前处理将青菜洗干净，称2.5 g样品于15 mL的离心管中，加入2 5 mL 6N的HC1， 超声波提取20min，然后将酸提取物离心后取上清液，利用旋转蒸发仪蒸干，然 后用适量PBS溶解，进行检测。2百草枯半定量速测试剂条产品的使用方法-取样品滤液75 ^L缓慢滴加于试纸条的加样孔中，5 30min内观察试纸条 上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定 样品提取液中百草枯的含量若只有C线显色则判定样液为阳性(大于0.05 mg/kg)，百草枯超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于0.05mg/kg)，百草枯没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。 3检测结果T线红色色带消失，样品中百草枯含量大于0.05mg/kg。 实施例3:饮用水中百草枯检测 1前处理 不经前处理。2百草枯半定量速测试剂条产品的使用方法取饮用水样75 pL缓慢滴加于试纸条的加样孔中，5~30 min内观察试纸条 上检测线(T线)、质控线(C线)的显色情况。根据试纸条的检测原理来限量判定 饮用水样中百草枯的含量若只有一条C线红色色带出现则判定样液为阳性(大 于0,05mg/kg)，百草枯超标；若出现两条红色色带则判定样液为阴性(小于0.05 mg/kg)，百草枯没有超标；若无色带出现则该试纸条失效。3检测结果T线红色色带消失，水样中百草枯含量大于0.05mg/kg。
权利要求
1、一种百草枯半定量速测试剂条的制备方法，其特征在于该测试条由样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水纸四部分组成；将制备好的金标抗体调成A520nm＝1.0的浓度，喷涂于金标垫上，37℃真空干燥后备用；用自动点样仪对硝酸纤维膜进行检测线性包被，下端横线检测线T包被百草枯人工抗原PQ-h-OVA，浓度为0.5mg/mL；上端横线质控线C包被羊抗兔IgG，浓度为0.11mg/mL，37℃真空干燥后备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水纸四部分依次相互叠加粘贴于试剂板上，以宽3.5mm/条切条后备用，即为百草枯半定量速测试剂条。
2、 如权利要求1所述方法制备的百草枯半定量速测试剂条的应用方法，其 特征是用其对试样进行检测(1) 小麦、玉米或大豆为检测试样准确称取2g粉碎均匀的试样，置于50 mL离心管中，加入2mL超纯水，摇匀，4200 rpm离心15 min，将上层清液取出， 取75 ML用试纸条检测；(2) 蔬菜或水果为检测试样将蔬菜或水果洗千净，称2.5 g样品于15 mL 的离心管中，加入2~5 mL 6N的HC1，超声波提取20 min，然后将酸提取物离心 后取上清液，利用旋转蒸发仪蒸干，然后用适量PBS溶解，取75 ML用试纸条检 测；(3) 水样或葡萄酒为检测试样不经前处理，可直接取75 ^L用试纸条进行检测。
全文摘要
一种百草枯半定量速测试剂条的制备与应用，属于生物技术领域。本发明涉及应用可特异性识别百草枯的抗体来制备一种百草枯半定量速测试剂条产品。其为实现我国粮谷、蔬菜及其制品中百草枯的快速检测开辟了广泛的应用前景，这种新型免疫速测产品的研制，不仅降低了检测成本，更为检测人员提供了安全检测的条件，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好，安全、环保等优点。
文档编号G01N33/543GK101324575SQ200810022758
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月10日 优先权日2008年7月10日
发明者孙秀兰, 张银志, 萌 杨, 杨婷婷 申请人:江南大学