用于肿瘤分子亚型分型的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】用于肿瘤分子亚型分型的方法和试剂盒
[0001]发明技术领域
[0002] 本发明涉及鉴定癌症患者中肿瘤的分子亚型的体外方法以及将癌症患者分类以 进行肿瘤治疗的方法。本发明还涉及用于鉴定癌症患者中肿瘤的分子亚型的试剂盒。
[0003] 发明背景
[0004] 肿瘤预后和治疗反应预测与肿瘤的分子亚型密切相关。当前世界上使用的检测癌 症如乳腺癌的受体状态的标准方法为由福尔马林固定且石蜡包埋的（FFPE)活组织切片或 切除组织的免疫组织化学（IHC)。目前，给予内分泌或靶向系统治疗（即曲妥单抗)大多是基 于 IHC。
[0005] FFPE样本制备和随后的利用特异性抗体的免疫组织化学染色是仅能在病理实验 室中进行的当前技术。从FFPE肿瘤组织的显微检查加上染色结果的解释，病理学家进一步 得到了关于肿瘤生物学和肿瘤扩散的临床上至关重要的信息。此外，病理学家对FFPE组织 检查的解释被认为是临床决策制定中的关键一栏。在许多国家，病理学家是乳腺癌管理决 策中所谓病例研讨会的主要部分。尽管IHC可在集中设施中容易地进行，检查病理学家的个 人见解和经验在个体病例决策中非常重要。
[0006] 然而，数项研究已证实，在多达40 %的免疫组织化学结果中存在明显的观察者间 差异和技术差异。此外，免疫组织化学仅允许定性，或在一些情况下半定量陈述关于各自的 受体状态。
[0007] 因此，需要可靠客观的定量和可重复的用于肿瘤如乳腺肿瘤的分子亚型分型的检 测系统，其有助于选择合适的肿瘤治疗方案（患者分类），并允许预后和预测治疗成功以及 评估患者的远处转移风险。此外，这样的检测系统应当允许进行适合大部分癌症患者的分 散检测。
[0008] 发明概述
[0009] 在一个方面，本发明涉及鉴定癌症患者中肿瘤的分子亚型的体外方法，所述方法 包括以下步骤：
[0010] (a)确定所述肿瘤的样本中人表皮生长因子受体2(HER2)的RNA转录本的表达水 平；
[0011] (b)确定所述肿瘤的样本中雌激素受体(ESRl)的RNA转录本的表达水平；
[0012] (c)确定所述肿瘤的样本中孕酮受体(PGR)的RNA转录本的表达水平;和
[0013] (d)确定所述肿瘤的样本中增殖抗原Ki-67(Ki67)的RNA转录本的表达水平;和/或
[0014] (e)确定所述肿瘤的样本中RacGTP酶激活蛋白l(RACGAPl)的RNA转录本的表达水 平。
[0015] 在一个实施方案中，确定HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA转录本的表达 水平包括确定HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA转录本的表达水平是低于还是高 于HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA转录本的设定表达阈值。
[0016] 在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)、（c)和(d)和/或(e)之前进行。
[0017] 在一个实施方案中，步骤(d)和/或步骤(e)在步骤(a)、(b)和(c)之后进行。
[0018] 在一个实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前进行，步骤(b)在步骤(c)之前进行，且 步骤(c)在步骤(d)和/或步骤(e)之前进行。
[0019] 在一个实施方案中，所述分子亚型选自HER2-阳性、三阴性、管腔A(luminal A)型 和管腔B(luminal B)型。
[0020] 在一个实施方案中，比HER2的RNA转录本的设定表达阈值高的HER2的RNA转录本的 表达水平，将肿瘤的分子亚型鉴定为HER2-阳性的。
[0021] 在一个实施方案中，
[0022]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0023]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值低的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0024]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值低的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0025]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值低或高的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0026]将肿瘤的分子亚型鉴定为三阴性的。
[0027] 在一个实施方案中，所述分子亚型为管腔A(luminal A)型或管腔B(luminal B) 型。
[0028]在一个实施方案中，
[0029]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0030]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值高的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0031]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值高的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0032]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值高的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0033] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminal B)型。
[0034]在一个实施方案中，
[0035]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0036]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值高的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0037]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值高的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0038]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值低的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0039] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔A(luminal A)型。
[0040]在一个实施方案中，
[0041 ]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0042]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值高的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0043]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值低的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0044]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值低或高的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0045] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminal B)型。
[0046]在一个实施方案中，
[0047]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0048]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值低的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0049]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值高的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0050]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值高的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0051 ] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminal B)型。
[0052]在一个实施方案中，
[0053]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0054]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值低的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0055]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值高的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0056]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值低的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0057] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔A(luminal A)型。
[0058]在一个实施方案中，
[0059]-比HER2的RNA转录本的设定表达阈值低的HER2的RNA转录本的表达水平；
[0060]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值高的ESRl的RNA转录本的表达水平；
[0061 ]-比PGR的RNA转录本的设定表达阈值低的PGR的RNA转录本的表达水平;和 [0062]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值高的Ki67的RNA转录本的表达水平 [0063] 将肿瘤的分子亚型鉴定为管腔B(luminal B)型。
[0064] 在一个实施方案中，所述管腔A型分子亚型与治疗后无远处复发存活5年的几率相 关，该几率比与管腔B型分子亚型相关的治疗后无远处复发存活5年的几率高至少11%，优 选至少13%，和/或所述管腔A型分子亚型与治疗后存活5年的几率相关，该几率比与管腔B 型分子亚型相关的治疗后存活5年的几率高至少7%，优选至少9%。
[0065] 在一个实施方案中，所述方法包括步骤(d)，并且
[0066]-比ESRl的RNA转录本的设定表达阈值高的ESRl的RNA转录本的表达水平 [0067]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值高的Ki67的RNA转录本的表达水平
[0068] 指示癌症患者不良临床结果的风险增加，特别是远处转移的风险增加。
[0069] 在一个实施方案中，所述方法包括步骤(e)，并且比RACGAP1的RNA转录本的设定表 达阈值高的RACGAP1的RNA转录本的表达水平，指示癌症患者的不良临床结果的风险增加。
[0070] 在一个实施方案中，所述方法包括步骤(d)和(e)，并且
[0071]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值低的Ki67的RNA转录本的表达水平，和
[0072] -比RACGAP1的RNA转录本的设定表达阈值高的RACGAP1的RNA转录本的表达水平
[0073] 指示癌症患者不良临床结果的风险增加。
[0074] 在一个实施方案中，所述方法包括步骤(d)和(e)，并且
[0075]-比Ki67的RNA转录本的设定表达阈值高的Ki67的RNA转录本的表达水平，和
[0076] -比RACGAP1的RNA转录本的设定的表达阈值高的RACGAP1的RNA转录本的表达水平
[0077] 指示癌症患者不良临床结果的风险进一步增加。
[0078] 在一个实施方案中，不良临床结果包括存活期、无复发存活期和无远处复发存活 期中的一种或多种的相对减少。
[0079] 在一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。
[0080] 在一个实施方案中，所述肿瘤为乳腺肿瘤或来源于乳腺肿瘤。
[0081] 在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
[0082] 在一个实施方案中，所述样本为提取自肿瘤的RNA。
[0083]在一个实施方案中，RNA转录本的表达水平通过逆转录(RT)定量PCR来确定。
[0084]在一个实施方案中，所述定量PCR为基于荧光的定量实时PCR。
[0085]在一个实施方案中，所述方法包括使用ESRl特异性的引物，和/或HER2特异性的引 物，和/或Ki67特异性的引物，和/或PGR特异性的引物，和/或RACGAP1特异性的引物，其中所 述ESRl特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 1和2的序列的至少10 个连续的核苷酸，所述HER2特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:4 和5的序列的至少10个连续的核苷酸，所述Ki67特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度 且包含SEQ ID NO:7和8的序列的至少10个连续的核苷酸，所述PGR特异性的引物具有15至 30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 10和11的序列的至少10个连续的核苷酸，所述 RACGAP1特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 13和14的序列的至少 10个连续的核苷酸。
[0086]在一个实施方案中，所述方法包括使用ESRl特异性的探针，和/或HER2特异性的探 针，和/或Ki67特异性的探针，和/或PGR特异性的探针，和/或RACGAP1特异性的探针，其中所 述ESRl特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:3的序列的至少15个连 续的核苷酸，所述HER2特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:6的序 列的至少15个连续的核苷酸，所述Ki67特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含 SEQ ID N0:9的序列的至少15个连续的核苷酸，所述PGR特异性的探针具有20至35个核苷酸 的长度且包含SEQ ID NO: 12的序列的至少15个连续的核苷酸，所述RACGAP1特异性的探针 具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 15的序列的至少15个连续的核苷酸。
[0087]在一个实施方案中，将所述表达水平针对肿瘤样本中一个或多个参照基因的（平 均)表达水平进行标准化。
[0088] 在一个实施方案中，所述一个或多个参照基因选自CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、 HPRTl和GAPDH。
[0089] 在其他方面，本发明涉及将癌症患者分类以进行肿瘤治疗的方法，所述方法包括， 第一步，使用如上文所述的体外方法鉴定癌症患者肿瘤的分子亚型，和第二步，基于通过所 述体外方法鉴定的分子亚型来选择肿瘤治疗方案。
[0090] 在一个实施方案中，所述分子亚型选自HER2-阳性、三阴性、管腔A(luminal A)型 和管腔B(luminal B)型。
[0091] 在一个实施方案中，
[0092]-所述分子亚型为HER2-阳性的，且所述肿瘤治疗方案包括施用抗HER2抗体和化疗 剂；
[0093]-所述分子亚型为三阴性的，且所述肿瘤治疗方案包括施用化疗剂；
[0094]-所述分子亚型为管腔A(luminal A)型，且所述肿瘤治疗方案包括内分泌疗法;或 [0095]-所述分子亚型为管腔B(luminal B)型，且所述肿瘤治疗方案包括内分泌疗法和 任选地施用化疗剂。
[0096] 在一个实施方案中，所述分子亚型为管腔B(luminal B)型，且所述肿瘤治疗方案 包括施用化疗剂。
[0097] 在一个实施方案中，所述分子亚型为管腔B(luminal B)型，且所述肿瘤治疗方案 包括施用紫杉烷，优选多西他赛。
[0098] 在一个实施方案中，所述紫杉烷联合氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(FEC)施用。
[0099] 在一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。
[0100] 在一个实施方案中，所述肿瘤为乳腺肿瘤或来源于乳腺肿瘤。
[0101] 在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
[0102] 在其他方面，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括，第一步，使用上文所述 的体外方法将癌症患者分类以进行肿瘤治疗，和第二步，向癌症患者提供选择的肿瘤治疗 方案。
[0103] 在其他方面，本发明涉及用于通过逆转录(RT)定量PCR的方法来鉴定癌症患者肿 瘤的分子亚型的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0104] -至少一对HER2特异性的引物和至少一种HER2特异性的探针；
[0105]-至少一对ESRl特异性的引物和至少一种ESRl特异性的探针；
[0106]-至少一对PGR特异性的引物和至少一种PGR特异性的探针;和 [0107]-至少一对Ki67特异性的引物和至少一种Ki67特异性的探针;和/或
[0108] -至少一对RACGAP1特异性的引物和至少一种RACGAP1特异性的探针。
[0109] 在一个实施方案中，所述定量PCR为基于荧光的定量实时PCR。
[0110] 在一个实施方案中，所述探针的检测基于扩增介导的探针置换。
[0111] 在一个实施方案中，所述探针为双标记探针，其包含荧光报告基团和荧光淬灭基 团。
[0112] 在一个实施方案中，所述试剂盒还包含逆转录酶和DNA聚合酶。
[0113] 在一个实施方案中，所述逆转录酶和聚合酶以酶混合物的形式提供，这允许一步 法逆转录(RT)定量PCR。
[0114] 在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一对参照基因特异性的引物和至少一 种参照基因特异性的探针。
[0115] 在一个实施方案中，所述参照基因为选自以下基因中的一种或多种:CALM2、B2M、 RPL3 7A、GUSB、HPRT1和GAPDH。
[0116] 在一个实施方案中，所述试剂盒还包含至少一种对照RNA样本。
[0117] 在一个实施方案中，所述引物提供小于120bp的扩增子大小。
[0118] 在一个实施方案中，所述ESRl特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含 SEQ ID NO: 1和2的序列的至少10个连续的核苷酸，和/或所述HER2特异性的引物具有15至 30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 4和5的序列的至少10个连续的核苷酸，和/或所述 Ki67特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:7和8的序列的至少10个 连续的核苷酸，和/或所述PGR特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 10和11的序列的至少10个连续的核苷酸，和/或所述RACGAP1特异性的引物具有15至30个核 苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 13和14的序列的至少10个连续的核苷酸。
[0119] 在一个实施方案中，所述ESRl特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含 SEQ ID NO:3的序列的至少15个连续的核苷酸，和/或所述HER2特异性的探针具有20至35个 核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:6的序列的至少15个连续的核苷酸，和/或所述Ki67特异性 的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO:9的序列的至少15个连续的核苷酸， 和/或所述PGR特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 12的序列的至 少15个连续的核苷酸，和/或所述RACGAP1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含 SEQ ID NO: 15的序列的至少15个连续的核苷酸。
[0120] 在一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。
[0121 ]在一个实施方案中，所述肿瘤为乳腺肿瘤或来源于乳腺肿瘤。
[0122] 在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
[0123] 在另一方面，本发明涉及如上文所述的试剂盒在鉴定癌症患者中肿瘤的分子亚型 中的应用。
[0124] 在另一方面，本发明涉及如上文所述的试剂盒在评估癌症患者的远处转移风险中 的应用。
【附图说明】
[0125] 图1概述本发明的方法作为亚型分类的常规方法(例如，IHC)后备和作为患者分类 的常规方法补充的可能应用。
[0126] 图2示出了评估HER2、ESR1、PGR、Ki67和RACGAPlmRNA的表达水平对于乳腺癌患者 的5年存活率的预后和预测价值的划分检验。首先通过HER2 mRNA表达水平将来自855例肿 瘤的可用数据分类以鉴定HER2-阳性肿瘤U阈值38)。通过ESRlmRNA表达水平将HER2-阴性 肿瘤进一步分类。A:通过Ki67mRNA表达水平（阈值31.7)接着PGR mRNA表达水平（阈值30.2) 将ESRl-阳性肿瘤U阈值34)进一步分类。B:可选地，通过PGR mRNA表达水平（阈值30.2)接 着Ki67mRNA表达水平（阈值31.7)将ESRl-阳性肿瘤U阈值34)进一步分类。这些数据的 Kaplan-Meier分析在图3和图4中示出。C:通过RACGAPlmRNA表达水平（阈值34.2)将Ki67-阳 性和Ki67-阴性肿瘤分类。为了增加用于RACGAP1的进一步分析的患者数目，在图中未给出 PGR的数据。PGR的进一步考虑并未改变关于RACGAP1的总体结果。数据(参见表3)显示低于 或高于设定阈值的RACGAPlmRNA表达水平与5年存活率的特别显著的差异相关。
[0127] 图3示出了具有HER2-阳性