包含SEQ ID NO:4和5的序列的至少10连续的核苷酸，和/或所述Ki67 特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:7和8的序列的至少10个连续 的核苷酸，和/或所述PGR特异性的引物具有15至30个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 10和 11的序列的至少10个连续的核苷酸，和/或所述RACGAP1特异性的引物具有15至30个核苷酸 的长度且包含SEQ ID NO: 13和14的序列的至少10个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所 述特异性引物包含上文所示序列的至少15个连续的核苷酸。
[0303]在一个实施方案中，所述ESRl特异性的引物具有SEQ ID NO: 1和2的序列，和/或所 述HER2特异性的引物具有SEQ ID NO:4和5的序列，和/或所述Ki67特异性的引物具有SEQ ID NO:7和8的序列，和/或所述PGR特异性的引物具有SEQ ID NO: 10和11的序列，和/或所述 RACGAP1特异性的引物具有SEQ ID NO: 13和14的序列。
[0304]在一个实施方案中，所述ESRl特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含 SEQ ID NO:3的序列的至少15个连续的核苷酸，和/或所述HER2特异性的探针具有20至35个 核苷酸的长度且包含SEQ ID N0:6的序列的至少15个连续的核苷酸，和/或所述Ki67特异性 的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO:9的序列的至少15个连续的核苷酸， 和/或所述PGR特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含SEQ ID NO: 12的序列的至 少15个连续的核苷酸，和/或所述RACGAP1特异性的探针具有20至35个核苷酸的长度且包含 SEQ ID NO: 15的序列的至少15个连续的核苷酸。在一个实施方案中，所述特异性探针包含 上文所示序列的至少20个连续的核苷酸。
[0305]在一个实施方案中，所述ESRl特异性的探针具有SEQ ID NO: 3的序列，和/或所述 HER2特异性的探针具有SEQ ID N0:6的序列，和/或所述Ki67特异性的探针具有SEQ ID NO: 9的序列，和/或所述PGR特异性的探针具有SEQ ID NO: 12的序列，和/或所述RACGAP1特异性 的探针具有SEQ ID NO: 15的序列。
[0306]优选地，如上文所定义的探针为双标记探针，其包含荧光报告基团和荧光淬灭基 团。
[0307]在一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤为乳腺肿瘤 或来源于乳腺肿瘤(例如，通过转移）。在一个实施方案中，所述癌症为乳腺癌。
[0308]如本文所用，术语"部件试剂盒(缩写为:试剂盒)"是指物件产品，其包含一个或多 个容器，以及任选地，数据载体。所述一个或多个容器可装有一种或多种上述部件或试剂。 试剂盒中可包含另外的容器，其含有例如，稀释剂、缓冲剂和其他试剂如dNTP。所述数据载 体可为非电子数据载体，例如图形数据载体如信息册、信息表、条形码或登录码，或者电子 数据载体如软盘、光盘(CD)、数字通用光盘(DVD)、微芯片或另外的基于半导体的电子数据 载体。所述登录码可允许登录数据库，例如互联网数据库、中央或分散数据库。所述数据载 体可包含在本发明的方法中使用试剂盒的说明。所述数据载体可包含RNA转录本如mRNA的 阈值或参照水平。在所述数据载体包含允许登录数据库的登录码的情况下，所述阈值或参 照水平储存于该数据库中。另外，所述数据载体可包含关于如何实施本发明的方法的信息 和说明。
[0309]在另一方面，本发明涉及使用上文所定义的用于鉴定癌症患者中肿瘤的分子亚型 的试剂盒。
[0310] 在另一方面，本发明涉及使用上文所定义的用于评估癌症患者的远处转移风险的 试剂盒。
[0311] 本发明克服了本领域免疫组织化学诊断方法及较新方法的当前标准和状态的主 要缺点。
[0312] 本发明允许肿瘤，特别是乳腺肿瘤的可靠的分子亚型分型，这将允许医师挑选最 合适的肿瘤治疗方案。
[0313]得益于评估4种或5种标志物(优选地，首先确定HER2的RNA转录本的表达水平）的 优选顺序，未发生将HER2-阳性错误分类为管腔A型和B亚型的情形，这一问题在基于层次簇 分析或相关分析的亚型分析中常有发生(Perou et al ·(2000) ,Nature，406:747-752;TCGA (Cancer Genome Atlas 如七￥<^1〇(2012)，似1：1^6,490:61-70)。此外，没有假阳性和临床上 的HER2-阴性肿瘤的错误分类，这些情形根据Perou等，可发生多达30%。
[0314] 本发明提供了验证/重新评估免疫化学分析的不确定或矛盾的结果的方法和试剂 盒，特别是在以下通过IHC鉴定的乳腺癌患者组中：ESR1/PGR阴性（占所有乳腺癌患者的约 30% )、ESR1/PGR弱阳性（占所有乳腺癌患者的约15% )、HER2 3+(肿瘤活检IHC，未通过切除 肿瘤IHC验证；占所有乳腺癌患者的约15 % )和HER 2+ (占所有乳腺癌患者的约20 % )。
[0315] 本发明的方法和试剂盒有助于支持或针对管腔型乳腺癌的辅助性/新辅助性化疗 的直接决策制定，因为可通过Ki67-和/或RACGAP1 RNA转录本的可靠检测来区分管腔A型和 管腔B型亚型。这对具有ESR1/PGR阳性且达至2级肿瘤的患者（占所有乳腺癌患者的约50%) 特别有用。
[0316]本发明允许区分具有明显不同的总体存活和无远处转移存活率的管腔A型和管腔 B型肿瘤。虽然管腔B型患者具有连续转移的高风险，特别是在治疗(例如，手术)后首个5年 中，管腔A型患者的风险是恒定的并且明显更低。因此，所述方法和试剂盒还允许评估患者 发生远处转移的风险。
[0317]通过使用本发明的方法，FinHER研究（Joensuu et al · (2006)，N Engl J Med， 354:809-820)中约77%的管腔型肿瘤被分配至低风险组管腔A型，并且没有中间风险组。此 外，分为管腔A型和管腔B型降低了组织学分级和结节状态(这两个参数通常对肿瘤预后非 常重要)的显著性。因此，关于2级肿瘤治疗的不确定性以临床相关方式得到解决。
[0318] 本发明的方法和试剂盒还允许预测对系统治疗的反应，这得益于ESRl、HER2、 Ki67,以及任选RACGAP1的RNA转录本表达水平的定量测定。这对具有不确定的IHC的>lcm 的侵入性乳腺癌的患者（占所有乳腺癌患者的约40% )特别有用。
[0319] 本发明的新颖之处不仅包括乳腺癌生物标志物的基于mRNA的预估，还包括亚型的 算法定义。除了低Ki67外，还将管腔A型定义的强制性PGR阳性纳入为原始标准，在本发明递 交时未包括在20113丨.6 &11〇11临床指导中。另外，显示超过预定阈值的册1?2 1111?^表达的肿 瘤被归类为HER2-阳性，而不管ESR1/PGR状态，其同样来源于2011国际指导，这一指导仍然 有效。所有这些新的方面均有助于本发明的基于RT-qPCR的方法和试剂盒的预测价值。事实 上，这些根据基于RT-qPCR的生物标志物预估的新技术和根据分类算法的新理论，提供了 FinHer临床试验中更精确且更有意义的患者亚型分型，这最终提供了多西他赛在辅助性治 疗环境中的益处的预测工具。
[0320]总之，本发明主要用于对至少50%的所有乳腺癌患者中治疗成功的预后和预测的 可靠的、可重复的和可定量评估的当前未满足的临床需求(还参见图1)。
[0321] 通过以下实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应理解为限制本发明的范 围。 实施例
[0322] 实施例1:通过逆转录(RT)定量PCR(RT-qPCR)测定mRNA表达水平
[0323] RNA分离自石蜡包埋福尔马林固定的组织（=FFPE组织）。更具体而言，使用高纯度 RNA石錯试剂盒（Roche，Basel，Switzerland)或XTRAKT RNA提取试剂盒XL(Stratifyer Molecular Pathology ,Cologne ,Germany)从5-1 Ομπι卷片的FFPE肿瘤组织提取总RNA，通过 Ribogreen RNA定量测定(Molecular Probes，Eugene，0R)来定量，并通过参照基因 RPL37A 片段的实时荧光RT-PCR鉴定质量。发现通过不同的方法比较连续切片的靶标基因的定量数 据时不同提取方法之间存在差异。为了本发明的目的，优选使用XTRAKT RNA提取试剂盒XL。 如以下所述通过qRT-PCR测定2.5μ1的每个合格RNA提取物(约50-1 OOng)。
[0324] 对于通过定量RT-PCR方法详细分析的基因表达，使用了目标区域两侧的引物和中 间杂交的焚光标记的探针。使用NCBI引物设计工具(www.ncbi .nlm.nih.go)挑选革E标特异 性引物和探针。使用了RNA特异性引物/探针序列，以能够通过定位穿过外显子/外显子边界 的引物/探针序列来进行RNA特异性测量。此外，挑选不与具有已知多态性(SNP)的序列区域 结合的引物/探针。在相同基因存在多种同种型的情况下，选择扩增所有相关的剪接变体的 引物。通过常规PCR反应检查所有引物对的特异性。在进一步优化引物/探针后，表1中列出 的引物和探针得到最佳结果。这些引物/探针优于现有技术已知的引物/探针，例如，在特异 性和扩增效率方面。为了标准化样本RNA的量，选择了基因 CALM2和B2M作为参照基因，因为 它们在分析的样本中未被差异调控。
[0325]
[0326] 表1.使用的引物和探针。
[0327] 进行了TaqMan?验证实验，表明靶标和对照扩增的效率近似相等，这是通过比较 Δ CT法对基因表达进行相对定量的先决条件。为了进行生物样本中目标基因的表达分析， 通过将两种特异性测定各自的引物/探针混合来制备4x双重测定-混合物。为了单独检测CT 值，利用不同的荧光探针修饰测定探针。每份4x测定-混合物含有2μΜ的未经修饰的正向和 反向引物和1.2μΜ的探针。对于每个反应，将提取自FFPE切片（参见上文）的2.5μ1总RNA与 2.5μ1测定-混合物，2.5μ1酶-混合物和2.5μ1水在96孔光反应板的一个孔中混合。根据厂商 的说明书，利用Versant kPCR循环仪(Siemens)或Light Cycler 480(Roche)，在合适的条 件（5min · 50°C，20sec · 95°C，15sec · 95°C，Imin · 60°C; 40个循环）下进行PCR反应的测量。在 测量目前还未分类的生物样本对照之前，可将具有例如细胞系、健康对照样本、确定分子肿 瘤亚型的样本的实验用于实验条件的标准化。
[0328] 实施例2:基于册1^、￡51^61^1(167，和任选1^^64?1的11^财表达水平的肿瘤的分 子亚型分型
[0329] 对于乳腺肿瘤的评估，可以使用FinHER研究（Joensuu et al · (2006)，N Engl J Med，354:809-820)的1010名乳腺癌患者中的855名。平均阈值（以40- Δ CT值给出）如下： 冊尺2:38$51?1:34;?61?:30,2 ;灯67:31，7;和1^06八？1:34,2。基于先前的研究（1(〇此抑8 6七 al.(2008),Brit.J. of Canc.,99：1775-1785；Pentheroudakis et al.(2009),Breast Cancer Res Treat 2009,116:131-143)的评估，使用268份样本确定HER2和ESRl的阈值，并 应用于FinHER研究（比例风险模型验证）XALM2用作参照基因。
[0330] 基于HER2、ESR1、PGR和Ki67的mRNA表达水平（阴性/低指示比设定的表达阈值低的 表达水平；阳性/增加指示比设定的表达阈值高的表达水平），将肿瘤指定为分子亚型HER2- 阳性(HER2)、管腔A型（LumA)、管腔B型(LumB)和三阴性(TNT)。如表2中所示，根据本发明的 肿瘤分子亚型分型不同于基于现有技术方法的那些，如免疫组织化学(Goldhirsch et al. (2011),Annals of Oncology，22:1736-1747，St·GalIen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011)和仅分析3种基因 标志物（Sotiriou et al .(2009)，N Engl J Med，360(8) :790-800)。
[0333] 表2.肿瘤的分子亚型分型。
[0334] 图2示出了评估HER2、ESR1、PGR、Ki67和RACGAPlmRNA的表达水平对于乳腺癌患者 的5年存活率的预后和预测价值的划分检验。这些数据表明低于或高于设定的阈值的 RACGAPlmRNA表达水平与5年存活率的特别显著差异相关。更特别地，增加的RACGAPlmRNA表 达水平显著降低存活几率。如果RACGAP1的mRNA表达增加，且Ki67mRNA表达较低，则存活几 率进一步降低（参见表3)。利用当前的分析方案，这些风险患者(其将需要不同类型的随访 护理，例如利用特定的成像方法检查)仍然未被发现。
[0336] 表3 · RACGAPl/Ki67mRNA 表达和存活几率。
[0337] 使用Kaplan Meier分析，本发明人分析了分别具有HER2-阳性、管腔A型、管腔B型 和三阴性肿瘤的患者的存活，其中肿瘤的分子亚型根据本发明进行鉴定，即基于HER2、 ESRl、PGR和Ki67的mRNA表达水平。如图3中所示，如本发明人所鉴定，管腔A型亚型伴随着 97%的5年后总体存活率(相比管腔B型和HER2-阳性肿瘤为87%及三阴性肿瘤为84% )。 [0338]本发明人还分析了分别具有HER2-阳性、管腔A型、管腔B型和三阴性肿瘤的患者的 无远处转移存活（"DMFS"；手术后X年远处复发），其中肿瘤的分子亚型根据本发明进行鉴 定。如图4中所示，如本发明人所鉴定，管腔A型亚型伴随着92%的5年后无远处转移存活率 (相比管腔B型、HER2-阳性和三阴性肿瘤为78% )。
[0339]在利用最重要的组织病理学标准参数(肿瘤大小、结节状态和组织学分级）的总体 存活的多元分析中，根据本发明的分子亚型分型被证明是非常显著的，而组织学分级和结 节状态失去了其显著性。
[0340] 最后，进行了 DMFS的多元Cox回归分析，其比较了通过免疫组织化学的分子亚型分 型（Sotiriou et aL· (2009)，N Engl J Med，360(8) :790-800)与通过根据本发明的基于 HER2、ESRl、PGR和Ki67的mRNA表达水平的方法的分子亚型分型（图5)。该分析明确表明了本 发明方法的优越性，因为在将通过本发明的方法获得的结果纳入至Cox比例风险模型中时， 免疫组织化学亚型分型失去了其显著性。
[0341] 实施例3:通过逆转录(RT)定量PCR(RT-qPCR)测量生物标志物HER2、ESR1、TOR、 Ki67的mRNA表达水平并确定分子亚型
[0342] RNA分离自FFPE组织。更具体地，使用XTRAKT RNA提取试剂盒（Strat if yer Molecular Pathology ,Cologne ,Germany)从ΙΟμπι FFPE乳腺肿瘤组织切片提取总RNAc3RNA 洗脱物直接使用而无需测定浓度。按下文所述通过RT-qPCR测定每种提取物的2.5μ1 RNA。
[0343] 对于RT-qPCR，将目标区域两侧的引物和用3 ' -TAMRA或3 ' -Dabcyl淬灭子进行5 ' -荧光标记的水解探针用于每个靶标。使用的引物和探针列于表1中。为了校正不同量的样本 RNA，将基因 CALM2和B2M用作标准化表达结果的参照基因。按下述组合以一式两份进行訂-qPCR: HER2/ESR1、Ki67/B2M和PGR/CALM2。3种4x测定混合物中的每一种含有2μΜ未修饰的正 向和反向引物及1.2μΜ探针。对于每个测定，制备了每个反应具有2.5μ1测定混合物、2.5μ1 4χ酶混合物（TaqManFast Virus 1-Step MasterMix，Life Technologies)和2· 5μ1 水的 master混合物，并将7 · 5μ1的每份master混合物以一式三份分配至kPCR 96孔反应板中。将 提取自FFPE切片的2.5μ1总RNA(参见上文），或者可选地，阳性（IVT RNA)或阴性对照(水)添 加至每个孔中。利用3个批次的测定混合物和酶混合物进行来源于3份患者样本的RNA洗脱 物的分析。根据厂商说明书，利用Versant kPCR循环仪(Siemens)，采用以下热特征进行一 步式RT-qPCR反应的测量：5min 50°C，20sec 95°C，每个反应一次循环，和15sec 95°C，lmin 60°C，进行40次循环。
[0344] 利用3个批次的测定混合物分析6份患者样本连同阳性和阴性对照。根据上文提供 的描述(计算方法4)计算40-△ ACT值。图6至图9显示了每个样本和批次的每种标志物的 40- Δ Δ CT值。用于分类生物标志物为阳性或阴性的阈值（以40- Δ Δ CT值给出）如下:HER2: 40.90;ESRl:38.20;PGR :34.90;Ki67:34.80。所述分子亚型按表4中所示的进行定义。
[0346] 表4.患者样本的分子亚型分型。
[0348] 表5.测定混合物批次1的40-Δ ACT值和亚型估计(calling)。
[0351] 表6.测定混合物批次2的40- Δ Δ CT值和亚型估计。
[0352]
[0353] 表7.测定混合物批次3的40- Δ Δ CT值和亚型估计。
[0354] 不同试剂批次间的结果仅可观察到轻微差异。对于所有标志物，测定性能均非常 强大且可重复。表5至表7显示了每种标志物的40-Δ ACT值和阳性或阴性结果以及转换成 表4中定义的各自的亚型（参见表2)。标志物结果（阳性/阴性)和亚型对于利用3种不同的试 剂批次测得的所有6份样本均是一致的。
[0355] 实施例4:通过RT-qPCR的乳腺癌亚型分型和根据临床结果的IHC的比较
[0356] 图10至图19示出了用不同化疗试剂（多西他赛或长春瑞滨)处理的不同肿瘤亚型 (管腔B型、HER2-阳性、管腔A型和三阴性乳腺癌[TNBC])的Kaplan-Meier存活曲线。通过根 据本发明的RT-qPCR确定的亚型在图A中示出，而通过IHC确定的亚型在图B中示出。虚线标 示了结果计算的5年时间点。
[0357] 图10至图19中所示的数据共同强调了新的通过RT-qPCR的基于RNA的乳腺癌分类 相比常规的基于蛋白的IHC的优势。所述数据显示了多西他赛治疗用于管腔B型肿瘤的明显 优势。相反，基于IHC的亚型分型未能在管腔A型、管腔B型和三阴性乳腺癌患者中具有一些 趋势的任何亚型中显示明显优势。然而，因为这3种亚型包括~80%的所有患者，所述基于 IHC的亚型分型不能提供任何临床上有用的预测信息。
[0358] 重要的是，在与氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺(FEC)联合治疗后，相比长春瑞滨， RT-qPCR确定的具有管腔B型肿瘤的患者得到来自多西他赛的统计上显著且独有的益处。这 些患者保持无转移且在用多西他赛治疗后存活明显更久，然而在接受长春瑞滨时其结果明 显更差。在除管腔B型外的任何其他亚型中均未观察到两种化疗方案之间的这种结果差